抗颗粒溶解素抗体、方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及抗颗粒溶解素（granulysin)抗体，尤其是其应用。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物免疫系统在控制体内微生物感染方面起着关键作用。而T细胞在此类免 疫反应上具有重要作用。有一类T细胞一一细胞溶解性T细胞（CTL)，其功能是将外来和受 病毒感染的细胞溶解。CTL介导的细胞溶解的主要作用机制设及方向性释放细胞质的颗粒 内容物，而W此使CTL和NK细胞开始将标祀细胞溶解。
[0003] 细胞质的颗粒内容物包括：成孔蛋白（穿孔蛋白，p&rforin)、丝氨酸蛋白酶 (颗粒酶）家族和晚期T细胞活化标记蛋白（颗粒溶解素）。颗粒溶解素对微生物和 肿瘤具有细胞溶解性。当颗粒溶解素附着于受感染的细胞上时，会在标祀细胞膜内产生 孔桐，而导致该细胞毁坏。此外，颗粒溶解素可诱发标祀细胞调亡，且亦具有抗微生物 作用。（Janew曰y,Ch曰rles(2005).Immunobiolo邑y:theimmunesysteminhe曰 1thand disease(6thed. ).NewYork:GarlandScience)
[0004] 人类颗粒溶解素是从=种独特的转录产物衍生，而被表达为具有两种分子量 巧kDa的15kDa)的蛋白质（参见图1)。颗粒溶解素为一种类皂素脂质结合蛋白。其结晶 构造（Anderson等人（2003)JMolBiol. 325(2) : 355-65)显示一种具有分布于环绕该分子 的环内的正电荷，和一个不具净正电荷的平面的五螺旋束（参见图2)。此外，颗粒溶解素是 由两个具高度保守性的分子内二硫键使结构稳定。
[0005] 虽然免疫反应在防御感染方面相当重要，但不希望的免疫反应却可能导致病症。 与不希望的免疫反应相关的病症例子包括不良药物反应（ADRs)、移植物对抗宿主疾病 (GVHD)、发炎性疾病、自体免疫疾病、移植排斥、过敏性疾病和T-细胞衍生的癌症。
[0006] 美国专利U.S. 7, 718, 378 (化en等人）公开了颗粒溶解素设及与不希望的免疫 反应关联的疾病、或细胞毒性T细胞介导的病症的病理，例如SJS(史提芬-强生征候群， Stevens-Johnsonsyn化ome)、TEN(毒性表皮坏死）和GVHD等。
[0007]SJS/TEN的致病原因尚未完全明了。然而，有害药物反应是运类病况的主要成因。 在2007年，FDA提出要求医师在进行卡己氮平治疗之前，先对患者筛检人类白细胞抗原 (HLA)等位基因HLA-B*1502,因为危险或甚至致死的皮肤反应（SJS和TEN)可能是由于运 类患者接受卡己氮平治疗所致。运类严重威胁生命的有害药物反应表现形式被确信是由免 疫作用所介导，因为W相同药物进行再刺激通常会缩短疾病潜伏期，而导致更严重的表现 形式（Roujeau等人，Toxicology, 2005Ap;r. 15 ;209 (2) : 123-9)。
[0008] 此外，对于SJS/TEN进行的临床、组织病理学、免疫细胞学和功能研究结果支持 SJS/TEN是一种由细胞毒性淋己细胞引发的特定药物敏感性反应的概念。先前的活体外研 究启示，该药物显示为第I类M肥限制型，其中包含CD8+CTLS纯株扩充，且运类细胞会诱 发效应细胞的细胞毒性反应。药物或其代谢物对于T-细胞活化的MHC限制型展示作用进 一步由最近发现的在HLA-B等位基因与对特定药物的反应间有强烈的遗传关联性所支持。 (Qumg等人化 1:ure, 2004Ap;r. 1 ;428 巧982) :486)。
[0009] 细胞毒性T细胞据观察会渗入SJS/TEN患者的皮肤病灶中（化ssif等人，Allergy Clin.Immunol. 2004November; 114巧）：1209-15)。水瘤液和表皮层中的T淋己细胞显示是 WCD8+ 表现型占优势（化ssif等人，J.Invest.Dermatol. 2002April; 118 (4) : 728-33)。运 类观察指出在SJS/TEN的致病过程中，存在由抗原引发的且具细胞毒性的T细胞添补至皮 肤。
[0010] 人们已发现颗粒溶解素是导致SJS/TEN的独特临床表现形式的关键分子。采自 SJS/TEN患者皮肤病灶的水瘤液，显示具有对B-细胞和角质细胞的细胞溶解活性，且含有 颗粒溶解素作为最主要的细胞毒性蛋白。而且，将颗粒溶解素注射入小鼠表皮，会诱发大量 的皮肤细胞死亡，类似在人类的SJS/TEN病理变化。因此，颗粒溶解素是导致散步的角质细 胞调亡的关键分子，且构成了SJS/TEN的致病机制中未知环节的基础。
[0011] 图3示出一个用来说明颗粒溶解素参与有害药物反应（例如，卡己氮平有害反应） 的可能机制的示意图。根据此推论的机制，该药物分子（抗原）与位于抗原提呈细胞（例 如角质细胞）上的M肥I结合，运会致使CD8+细胞毒性T细胞活化。所述的药物与M肥I 的相互作用当该等位基因是HLA-B*1502且该药物是卡己氮平时最为显著。T细胞的活化作 用尤其促使颗粒溶解素产生。接着，颗粒溶解素会引发角质细胞调亡（和细胞溶解）。
[0012] 在急性GV皿中，颗粒溶解素在血清中显著增加，且颗粒溶解素在血清中的含 量与GV皿的严重程度正相关。此外，已显示协同特异性T细胞在体外会W同种特异性 (allo-specific)方式释放出颗粒溶解素，而该颗粒溶解素释放与同种特异性细胞毒性活 性正相关。运类结果表示，颗粒溶解素在GVHD中起着重要作用。（化gasawa等人2006,Am. J.Hematol. 81 巧）：；34〇-8)。
[0013] 上述观察启示，颗粒溶解素在运类不希望的免疫反应病症中具有重要作用。因此， 颗粒溶解素可作为诊断和治疗此类不希望的免疫反应病症的目标物。
【发明内容】
[0014] 本发明的实施方案设及一种能够中和颗粒溶解素的细胞毒性和抗微生物活性的 抗体。所述抗体可为多株抗体或单株抗体。
[0015] 在一个方面，本发明设及能够中和颗粒溶解素活性的抗颗粒溶解素抗体。本发明 的抗体能与位于颗粒溶解素（granulysin)的氨基酸R64至R113(SEQIDN0:81)的抗原决 定区（epitoperegion)结合。
[0016] 根据本发明的任一实施方案，所述抗体可W包括选自SEQIDN0:82至SEQID NO: 195的序列，或选自沈QIDNO:39至沈QIDNO:76的序列。
[0017] 根据本发明的一些实施方案，所述抗体可W包括下列序列：SEQIDN0:82直到SEQ IDN0:87,或沈QIDN0:88直到沈QIDN0:93,或沈QIDN0:94直到沈QIDN0:99,或沈Q IDNO: 100 直到沈QIDNO: 105,或沈QIDNO: 106 直到沈QIDNO: 111，或沈QIDNO: 112 直到沈QIDNO: 117,或沈QIDNO: 118直到沈QIDNO: 123,或沈QIDNO: 124直到沈Q IDNO: 129,或沈QIDNO: 130直到沈QIDNO: 135,或沈QIDNO: 136直到沈QIDNO: 141， 或沈QIDNO: 142 直到沈QIDNO: 147,或沈QIDNO: 148 直到沈QIDNO: 153,或沈QID NO: 154 直到沈QIDNO: 159,或沈QIDNO: 160 直到沈QIDNO: 165,或沈QIDNO: 166 直 到沈Q ID NO: 171，或沈Q ID NO: 172直到沈Q ID NO: 177,或沈Q ID NO: 178直到沈Q ID NO: 183,或沈Q ID NO: 184直到沈Q ID NO: 189,或沈Q ID NO: 190直到沈Q ID NO: 195。
[0018] 根据本发明的些实施方案，所述抗体可W包括下列序列：SEQID NO:39和SEQID NO: 40,或沈Q ID NO: 41和沈Q ID NO: 42,或沈Q ID NO: 43和沈Q ID NO: 44,或沈Q ID NO: 45和沈Q ID NO: 46,或沈Q ID NO: 47和沈Q ID NO: 48,或沈Q ID NO: 49和沈Q ID NO: 50,或沈Q ID NO: 51和沈Q ID NO: 52,或沈Q ID NO: 53和沈Q ID NO: 54,或沈Q ID NO: 55 和沈Q ID NO: 56,或沈Q ID NO: 57和沈Q ID NO: 58,或沈Q ID NO: 59和沈Q ID NO: 60,或沈Q ID NO: 61和沈Q ID NO: 62,或沈Q ID NO: 63和沈Q ID NO: 64,或沈Q ID NO: 65 和沈Q ID NO: 66,或沈Q ID NO: 67和沈Q ID NO: 68,或沈Q ID NO: 69和沈Q ID NO: 70,或沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 72,或沈Q ID NO: 73和沈Q ID NO: 74,或沈Q ID NO:75和沈Q ID NO:76。
[0019] 根据本发明的一个实施方案，所述抗体可为单株抗体。根据本发明的任一实施方 案，所述抗体可为人源化抗体或人类抗体。根据本发明的实施方案，抗体可预防颗粒溶解素 的细胞毒性。
[0020] 在另一个方面，本发明设及一种治疗不希望的免疫反应病症的方法，所述方法通 过W前述任一抗颗粒溶解素抗体给给有需要的患者服药。根据本发明的任一实施方案，所 述不希望的免疫反应病症为SJS、TEN或GV皿。
[0021] 通过下列说明和所附的权利要求书，本发明的其他方面和优点将清楚明了。
【附图说明】
[0022] 图1表示颗粒溶解素的结构图，包括9kDa颗粒溶解素的15kDa颗粒溶解素。
[0023] 图2表示颗粒溶解素的=维立体结构图，说明颗粒溶解素的五螺旋束构造。
[0024] 图3为用m兑明设及由颗粒溶解素所介导的细胞毒性的可能机制的示意图。
[0025] 图4是说明用于产生根据本发明的实施方案的抗颗粒溶解素抗体的流程图。
[0026] 图5示出各种抗颗粒溶解素抗体降低颗粒溶解素毒性的能力。
[0027] 图6是用来说明使用隧菌体展示方法鉴定出抗颗粒溶解素抗体的示意图。
[0028] 图7表示各种抗颗粒溶解素抗体的CDR序列。
[0029] 图8是用来分析各种抗颗粒溶解素抗体减低颗粒溶解素的抗微生物活性的试验 流程示意图。
[0030] 图9表示各种抗颗粒溶解素抗体减低颗粒溶解素的抗微生物活性的结果。
[0031]图10表示各种抗颗粒溶解素抗体减低颗粒溶解素的抗微生物活性的结果。
[0032] 图11表示各种抗颗粒溶解素抗体与颗粒溶解素的结合动力学试验。
[0033] 图12是用W制造颗粒溶解素突变体的流程示意图。
[0034] 图13A-130表示各种抗颗粒溶解素抗体与颗粒溶解素和突变型颗粒溶解素的各 种试验。
[0035] 图14A-14J表示各种抗颗粒溶解素抗体与具有不同定点突变（单氨基酸丙氨酸扫 描）的颗粒溶解素的各种试验。
[0036] 图15是说明在颗粒溶解素作用中，精氨酸正电荷参与和带负电荷的憐脂质层的 交互作用的示意图。
[0037] 图16表示颗粒溶解素的=维立体结构图，说明位于一个表面上的带电荷残基。
[0038] 图17表示位于颗粒溶解素蛋白上各种对应不同单株抗体的抗原决定基。
[0039] 图18表示各种抗颗粒溶解素抗体与颗粒溶解素突变体的结合的分析结果，说明 其逆转颗粒溶解素的抗微生物活性的能力及其CDR序列。
[0040] 图19为列示一种用于评估抗体与根据本发明的一个实施方式的变性颗粒溶解素 的结合的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0041] 本说明书中，术语"抗体"意指一种免疫球蛋白分子或其具有免疫学活性的部分， 亦即抗原结合部分或其片段。因此，抗体包括至少一段（优选两段）重（H)链可变区（Vh)， 和至少一段（优选两段）轻（L)链可变区（\)。Vh和Vl区可进一步细分成高可变区（即 "互补决定区"（"CDR")")，其间穿插较保守性的区域（即"骨架区"（"FR"))。每一段Vh 和\是各由S段CDR与四段FR所组成，从氨基末端到簇基末端依序排列为：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。