间皮素结构域-特异性单克隆抗体及其用图
【专利说明】间皮轰结构域-特异性单克隆抗体及其用途
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年8月21日提交的美国临时申请号61/691，719的优先权，所述 申请W引用的方式全文纳入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容设及特异性针对间皮素的单克隆抗体，特别是针对间皮素的片段的单 克隆抗体，及其用于癌症的诊断和治疗的用途。
【背景技术】
[0004] 人间皮素是一种40kDa的细胞表面的糖基憐脂酷肌醇（GPI)-连接的糖蛋白。该蛋 白质作为7〇kD的前体被合成，然后被蛋白水解处理。间皮素的30KD氨基末端被分泌出来， 并被称为巨核细胞强化因子（Yamaguchietal.，J.Biol.Chem. 269 :805808,1994)e40kD的 簇基末端作为成熟的间皮素与膜保持结合（化angetal.，化tl.Acad.Sci.USA93 :136140， 1996)〇
[0005] 间皮素W相对低的水平存在于健康个体的胸膜、腹膜及屯、包膜的间皮细胞中，但 在许多不同的癌症中高度表达，所述癌症包括间皮瘤、胃癌、鱗状细胞癌、前列腺癌、膜腺 癌、肺癌、胆管癌（cholangiocarcinoma)、乳腺癌和卵巢癌（Hassanetal.，Clin.Cancer Res. 10:3937-3942,2004;McGuireetal.，N.E；ngl.J.Med.3；34:l-6，1996;Arganietal.， Clin.CancerRes. 7 :3862-3868,2001;Hassanetal.，Appl.Immunohistochem.Mol. Mo;rphol. 13 :243-247,2005;Lietal.，Mol.CancerHier. 7 :286-296,2008 ;化etal.， JCancer1:141-1749,2010;Tchouetal.，&reastCancerResTreat133(2) :799-804， 2012 ;美国专利号7, 081，518)。具体而言，已有报道称大多数卵巢浆液性癌和膜腺腺癌表 达高水平的间皮素（Yenetal.，Clin.CancerRes. 12:827-831,2006)。此外，已经在多 于55%的肺癌和多于70%的卵巢癌中检测到高水平的间皮素化assanetal.，Appl. Immunohistochem.Mol.Morphol. 13 :243-247,2005;Hoetal.，Clin.CancerRes. 13(5)： 1571-1575,2007)。间皮素在正常细胞中的有限表达使其成为用于肿瘤免疫治疗的可行祀 标。
[0006] 间皮素也可W用作用于某些类型的癌症的诊断和预后的标记物，运是因为可W在 一些患有间皮素-阳性的癌症的患者的血液中检测到痕量的间皮素（化istaudoetal.， Clin.CancerRes. 13:5076-5081，2007)。据报道，可W通过缺失间皮素簇基末端或者通 过从间皮素的膜结合形式上蛋白水解性切割，而将间皮素释放到血清中Ofassanetal.， Clin.CancerRes. 10 :3937-3942, 2004)。在暴露于石棉的工人中出现恶性间皮瘤之前的几 年，可W检测到可溶形式的间皮素的增加（化ean巧andRobinson,化matol.化col.Clin. NodhAm. 19 :1025-1040,2005)。此外，患有卵巢癌，膜腺癌和肺癌的患者的血清中也含有 增多的可溶性间皮素（Cristaudoetal.，Clin.CancerRes. 13 :5076-5081，2007;Hassan etal.，Clin.CancerRes. 12 :447-453,2006;Crosoetal.，CancerDetect.Prev. 30 : 180-187,2006)。
【发明内容】
[0007] 本文公开了一组W高度亲和力结合全长间皮素和/或间皮素片段的单克隆抗体。 本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子，如IgG抗体，W及抗体片段。还提供了包含与间皮素 结合例如特异性结合的抗体的组合物，编码运些抗体的核酸分子，包含所述核酸分子的表 达载体，W及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。还提供了包含本文公开的抗体和效应 分子（例如毒素）的免疫缀合物。
[0008] 本文提供的抗体和组合物可用于各种目的，例如用于确认对表达间皮素的癌症的 确断，所述癌症例如间皮瘤，前列腺癌，肺癌，胃癌，鱗状细胞癌，膜腺癌，胆管癌，乳腺癌或 卵巢癌。因而，本文提供了通过W下方式确认受试者中的癌症的诊断的方法：使来自被诊断 患有癌症的受试者的样品与结合间皮素的单克隆抗体接触，并检测所述抗体与所述样品的 结合。相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合增加，则确认所述癌 症诊断。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使特异性识别所述间皮素-特异性抗体 的第二抗体与所述样品接触，并检测所述第二抗体的结合。
[0009] 类似地，本文提供了一种检测受试者中的表达间皮素的癌症的方法。所述方法包 括使来自所述受试者的样品与本文所述的单克隆抗体接触，并检测所述抗体与所述样品的 结合。所述抗体与所述样品的结合相对于对照样品的增加检测出所述受试者中的癌症。在 一些实施方案中，所述方法进一步包括使特异性识别所述间皮素-特异性抗体的第二抗体 与所述样品接触，并检测所述第二抗体的结合。
[0010] 还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述癌症例如间皮瘤，前列腺癌，肺 癌，胃癌，鱗状细胞癌，膜腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。所述方法是通过W下方式进行：选 择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的特异性针对间皮素的 单克隆抗体或者包含所述抗体的免疫缀合物。
[0011] 还提供了一种抑制受试者的肿瘤生长或转移的方法，所述方法是通过W下方式进 行：选择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的本文公开的抗 体、免疫缀合物或组合物。
[0012] 根据下面的参照附图进行的详细描述，本发明前述的和其它的目标、特征和优点 将变得更加明显。
【附图说明】
[0013] 图1是间皮素的结构示意图。目前的抗-间皮素的治疗性抗体和免疫毒素（包括 SS1P和MORAb-009)识别细胞表面间皮素的高免疫原性N-末端区域I内的表化该N-末端 区域I内的表位也结合粘蛋白MUC16/CA125。
[0014] 图2A-2D为示出了通过ELISA对结构域特异性兔单克隆抗体（mAb)的表征的图。 用5yg/mL的全长间皮素（全长）、区域I(第296-390位残基）、区域II(第391-486位残 基）和区域III(第487-598位残基）片段包被化ISA板。将区域ImAb克隆（图2A)，区 域IImAb克隆（图2B)，区域IIImAb克隆（图2C)，W及构象敏感性mAb克隆（图2D)的 兔杂交瘤上清液加入化ISA板中，通过山羊抗兔IgG轻链-特异性HRP缀合物检测与间皮 素或其片段结合的兔mAb。
[001引图3A-3D为示出了兔mAb与NCI-肥26(间皮瘤）细胞系的结合的流式细胞术点图。 将NCI-H226细胞（1X106)与区域I结合物（图3A)、构象敏感性结合物（图3B)、区域III 结合物（图3C)和区域II结合物（图3D)的兔杂交瘤上清液（用FACS缓冲液1:2稀释） 解育。通过山羊抗兔IgGPE缀合物检测兔mAb与细胞表面间皮素的结合。
[0016] 图4为示出了S明治化ISA结果的图，其评估了在SS1P免疫毒素的存在下，不同 稀释度的YP187、YP223、YP218和YP3与间皮素片段的结合。用SS1P免疫毒素（1yg/mL) 包被化ISA板。将重组间皮素蛋白（lyg/mL)加入板中。洗涂后，加入兔mAb上清液（1:3 系列稀释）。最后，加入山羊抗兔IgG轻链HRP缀合物（1:5000)W检测兔mAb的结合。
[0017] 图5为示出明治ELISA的结果的图，其评估了（在SS1P免疫毒素的存在下） YP187、YP223、YP218和YP3与不同浓度的重组间皮素的结合。将SS1P免疫毒素巧yg/mL) 包被在ELISA板上。从10yg/mL开始1:3系列稀释重组间皮素蛋白，并加入到ELISA板中。 洗涂后，加入兔mAb上清液（1:5)。加入山羊抗兔IgG轻链（1:5000)HRP缀合物W检测兔 mAb的结合。
[001引图6A-6C为示出了通过化ISA进行的间皮素结合亲和力（Kd)的测量的图。将不同 量的兔mAbYP223 (图6A)、YP218 (图6B)和YP3 (图6C)与固定量的间皮素（1yg/mL)在 室溫下解育1小时。然后洗涂该板，进行标准的ELISA程序W测定兔mAb与间皮素的结合。 通过适用于Windows的PrismO. 02 版本）（Gra地Padsoftware,SanDiego,CA)确定亲和 力K0值。YP223、YP218 和YP3 的KD值分别是 0. 65nM、0. 91nM和 0. 42nM。
[0019] 图7A-7B为示出了通过S明治化ISA进行的对培养物上清液中的可溶性间皮素的 检测的图。用SS1P巧yg/mL)包被ELISA板。加入H9 (图7A)或K5 (图7B)的培养物上清 液（1:3系列稀释）。洗涂后，加入兔mAb培养物上清液（1:5)。使用山羊抗兔轻链特异性 HRP缀合物（1:5000)检测兔mAb的结合。
[0020] 图8A和8B为示出了YP158与癌细胞和组织中的间皮素的结合的免疫印迹。（图 8A)人肝癌细胞系中的间皮素蛋白的免疫印迹分析。除A431和H9 (仅上样2yg的总蛋白） 夕F，每种样品都上样40yg的全细胞裂解物。（图8B)癌症样品中的间皮素蛋白的免疫印迹 分析。使用0VCAR3 (人卵巢癌细胞系）和H9 (A431.MSLN+)作为阳性对照。使用A431 (MSLN-) 作为阴性对照。MSLN:间皮素（~40kDa);前体：~70kDa。
[0021] 图9示出了A431/H9(表皮样癌A431细胞中强制表达间皮素）、NCI-肥26(间皮 癌）和KMBC(胆管癌）细胞提取物中的内源性间皮素蛋白的免疫沉淀。使用针对间皮素的 人mAbOiAb)拉下所述细胞裂解物中的内源性间皮素蛋白。使用YP158探测拉下的蛋白质 中的天然间皮素。C:不相关的VH单-结构域人Fc融合蛋白；IP:免疫沉淀；输入：在免疫 沉淀前，对全细胞裂解物的蛋白质印迹。
[0022] 图10为示出了在SS1P免疫毒素的存在下对可溶性间皮素的检测的图。该测定在 S明治ELISA中使用YP223 (区域II结合物）和YP218 (区域III结合物）。即使在SS1P 免疫毒素的存在下，也检测到了可溶性间皮素。
[0023] 图11为示出了抗间皮素免疫毒素针对表达间皮素的细胞的结合亲和力的图。通 过流式细胞术测定并通过巧光强度指示免疫毒素与运些细胞系的结合。hYP218scFv-PE38 是人源化的YP218SCFV-PE38。人源化的YP218Fv对H9细胞的结合亲和力与最初的兔 YP218FV的结合亲和力相似（Kd=~4nm)。
[0024]图12为示出了YP218scFv-PE38对4种恶性间皮瘤患者原代细胞系的细胞毒性的 一系列图。在所述4种原代细胞系（RH16、RH18、RH19和R肥1)中，3种对抗间皮素免疫毒素 敏感。在所述3种敏感的原代系（RH16、RH19和R肥1)中，YP218scFv-PE38的效力是SS1P 的2至5倍。
[00巧]图13为示出了在人恶性间皮瘤模型中YP218scFv-PE38免疫毒素比SS1P更有效 的图。将6周的雌性BALB/cnu/nu小鼠腹膜内接种3X1〇6个稳定表达高水平的Luc/GFP 的NCI-肥26间皮瘤细胞。在第12、14、16和18天，对小鼠腹膜内给予SS1P化4mg/Kg)、 YP218scFv-PE38(0. 4mg/Kg)或载体（PBS)。通过生物发光光度法测定肿瘤生长，每周3次。 基于对照（载体）组，标准化相对生物发光活性。箭头指示注射。N= 5只/组。
[002引序列表
[0027] 所附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用37C.F.R1.822中定义的核巧酸 碱基的标准字母缩写和氨基酸的=字母编码显示。仅示出了每个核酸序列的一条链，但 是应理解任何对所示链的提及均包括互补链在内。序列表W创建于2013年8月14日的 78. 7邸的ASCII文本文件提交，并W引用的方式纳入本文。在所附的序列表中：
[002引 SEQIDNO: 1是假单胞菌外毒素牌）的氨基酸序列。
[0029] 沈QIDNO:2是阳38的氨基酸序列。
[0030] 沈QIDNO: 3是阳-LR的氨基酸序列。
[0031] 沈QIDNO: 4是阳-LR/6X的氨基酸序列。
[003引SEQIDNO:5是具有降低免疫原性的阳的氨基酸序列。
[0033] 沈QIDNO: 6是阳-LR/8M的氨基酸序列。
[0034]SEQIDNO:7是人间皮素的氨基酸序列。
[003引 SEQIDNO:8是YP223VH结构域的核巧酸序列。
[0036]SEQIDNO:9是YP223VH结构域的氨基酸序列。
[0037] 沈QIDNO: 10是YP223化结构域的核巧酸序列。
[0038] 沈QIDNO: 11是YP223化结构域的氨基酸序列。
[0039] 沈QIDN0:12是YP218VH结构域的核巧酸序列。
[0040] 沈QIDN0:13是YP218VH结构域的氨基酸序列。
[0041] 沈QIDNO: 14是YP218化结构域的核巧酸序列。
[0042] 沈QIDNO: 15是YP218化结构域的氨基酸序列。
[0043] 沈QIDNO: 16是YP3VH结构域的核巧酸序列。
[0044] 沈QIDNO: 17是YP3VH结构域的氨基酸序列。
[0045] 沈QIDNO: 18是YP3化结构域的核巧酸序列。
[0046] 沈QIDNO: 19是YP3化结构域的氨基酸序列。
[0047] 沈QIDN0:20是YP187克隆1VH结构域的核巧酸序列。
[0048] 沈QIDN0:21是YP187克隆1VH结构域的氨基酸序列。
[0049] 沈QIDNO:22是YP187化结构域的核巧酸序列。
[0050] 沈QIDNO:23是YP187化结构域的氨基酸序列。
[0051]SEQIDN0:24是YP158VH结构域的核巧酸序列。
[0052] SEQIDN0:25是YP158VH结构域的氨基酸序列。
[005引 SEQIDN0:26是YP158VL结构域的核巧酸序列。
[0054] SEQID側:27是￥?158化结构域的氨基酸序列。
[005引 SEQIDN0:28是YP187克隆2VH结构域的核巧酸序列。
[0056] 沈QIDN0:29是YP187克隆2VH结构域的氨基酸序列。
[0057] 沈QID側:30是￥?2183〇。￥斗638免疫毒素的核巧酸序列。
[0058] 沈QIDN0:31是YP218scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
[0059] 沈QIDN0:32是人源化YP218scFv-PE38免疫毒素的核巧酸序列。
[0060] 沈QIDN0:33是人源化YP218scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
[0061] 沈QID側:34是￥?2233〇。￥斗638免疫毒素的核巧酸序列。
[0062] 沈QID ^:35是￥?2233〇。￥斗638免疫毒素的氨基酸序列。
[0063] SEQIDN0:36是YP3scFv-PE38免疫毒素的核巧酸序列。
[0064] 沈QID ^:37是￥?33〇。￥斗638免疫毒素的氨基酸序列。
[0065] 沈QID側:38是￥?1873〇。￥斗638免疫毒素的核巧酸序列。
[0066] 沈QID ^:39是￥?1873〇。￥斗638免疫毒素的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0067] I.缩写
[0068] CAR 嵌合抗原受体
[006引 CDR 互补决定区
[0070] CTL 细胞毒性T淋己细胞
[0071] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0072] EM 效应分子
[0073] FACS 巧光激活细胞分选
[0074] GPI 糖基憐脂酷肌醇
[00巧]HRP 辣根过氧化物酶
[007引Ig 免疫球蛋白
[0077] Kd 解离常数
[007引 mAb 单克隆抗体
[0079] PE 假单胞菌外毒素
[0080] PE 藻红蛋白
[0081] VH 重链可变区
[0082] VL 轻链可变区
[0083] II.术语和方法
[0084] 除非另外指明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学常用术语的定义 可见于BenjaminLewin,GenesV,publishedbyOxfordUniversityPress, 1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrewetal. (eds.) ,TheEncyclopediaofMolecular Biology,publishedbyBlackwellScienceLtd., 1994(ISBN0-632-02182-9);和 RobertA.Meyers(ed. ),MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDesk Reference,publishedbyVCHPublishers,Inc. ,1995(ISBN1-56081-569-8)。
[0085] 为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了W下对具体术语的解释：
[0086] 抗体：至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肤配体，其识别并结合（例如 特异性识别并特异性结合）抗原（例如间皮素）或其片段的表位。免疫球蛋白分子包含重 链和轻链，所述重链和轻链各自具有可变区，称为重链可变区（Vh)和轻链可变区（\)。所 述Vh区和V返一起负责结合被抗体识别的抗原。
[0087] 抗体包括完整的免疫球蛋白W及本领域公知的抗体的变体和部分，例如单结构域 抗体（例如VH结构域抗体）、F油片段、F油'片段、F(油)'2片段、单链Fv蛋白（"scFv") 和二硫键稳定的Fv蛋白（disulfidest油ilizedFvproteins, "dsFv")。scFv蛋白是 其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在 dsFv中，所述链被突变W引入二硫键来稳定所述链的连接。术语"抗体"还包括遗传改造的 形式例如嵌合抗体（例如人源化鼠抗体）和异缀合抗体化eterocon化gateantibody)(例 如双特异性抗体）。还可见于PierceCatalogandHanclbook, 1994-1995(PierceQiemical Co. ,Rockford,IL) ;Kuby,J. ,Immunology,3rdEd. ,W.H.Freeman&Co. ,NewYork, 1997。
[0088] 通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重（H)链和轻（L)链。存 在两种轻链类型：A和K。存在5种决定抗体分子功能活性的主要重链类别（或同种型）： IgM、I曲、IgG、IgA和I姐。
[0089] 每条重链和轻链均含有恒定区和可变区（所述区还称为"结构域"）。组合起来， 重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链和重链可变区含有被=个高变区（也 称为"互补决定区"或"CDR")隔开的"框架"区。已经根据K油atetal.(参见K油atet al.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealth andHumanServices, 1991)和ImMunoGeneTics数据库（IMGT)(参见，Lefranc,Nucleic AcidsRes29:207-9,2001)限定了框架区和CDR的范围。K油at数据库保持在线。不同的 轻链或重链的框架区的序列在同一物种例如人内是相对保守的。抗体的框架区，也就是成 分轻链和重链的结合框架区，用于在=维空间中安置和排列所述CDR。
[0090] CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR-般被称为CDRUCDR2和CDR3,从 N端开始顺序编号，并且通常通过所述具体CDR所在的链来鉴定。因此，VhCDR3(或H-CDR3) 位于其所在抗体的重链可变区，而\CDR1 (或kCDRl)是来自其所在抗体的轻链可变区的 CDR1。例如，结合间皮素的抗体会具有特定的Vh区和VL区序列，并因此具有特定的CDR序 列。具有不同特异性的抗体（即，对不同的抗原有不同的结合位点）具有不同的CDR。虽然 抗体与抗体之间的CDR不同，但是仅CDR内有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR 内的运些位置被称为特异性决定残基（SDR)。
[00川提及"V，或"VH"时，是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或F油 的免疫球蛋白重链可变区。提及"或"VL"时，是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、 scFv、dsFv或F油的免疫球蛋白轻链可变区。
[0092]"单克隆抗体"是由B-淋己细胞的单个克隆或由其中已转染单一抗体的轻链和/ 或重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体是由本领域技术人员所知晓的方法产生的，例 如通过骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合体制备形成杂合抗体的细胞。单克隆抗体包括人源 化单克隆抗体。
[0093]"嵌合抗体"含有来自两种或更多种通常来自不同动物物种的不同抗体分子的 结构元件。例如，嵌合抗体可W具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一物种的 CDR(其通常赋予抗原W结合性）例如特异性结合间皮素鼠抗体。
[0094]"人"抗体（也称为"全人"抗体）是包含人框架区和人免疫球蛋白的全部CDR的 抗体。在一个实例中，所述框架和所述CDR是来自相同来源的人重链和/或轻链氨基酸序 列。然而，可W改造一种人抗体的框架W包