[0353] 高亲和力的mAb结合位点的表征
[0354] 基于上述的结合数据，4个克隆被选择用于进一步的分析：
[0355]YP187-区域II结合物
[0356]YP223 -区域II结合物
[0357]YP218 -区域III结合物
[035引YP3-构象敏感的
[0359] 使用S明治ELISA确定兔mAb是否结合间皮素中不同于SSlP/MORAb-009 (区域I) 位点的位点。在第一个实验中，使用不同浓度的每种mAb克隆评估在存在SS1P的情况下 YP187、YP223、YP218和YP3与重组间皮素的结合。用SS1P免疫毒素（1yg/mL)包被化ISA 板。将重组间皮素蛋白（lyg/mL)被加入到该板中。洗涂后，加入兔mAb上清液（1:3系 列稀释），并使用山羊抗兔IgG轻链HRP缀合物（1:5000)检测兔mAb的结合。结果表明， YP187、YP223、YP218和YP3都识别不同于SS1P位点的位点（图4)。
[0360] 在第二个实验中，使用不同浓度的重组间皮素评估在SS1P的存在下YP187、 YP223、YP218和YP3与重组间皮素的结合。将SS1P免疫毒素巧yg/mL)包被在化ISA板 上。1:3系列稀释重组间皮素蛋白（从lOiig/血开始），并将其加到化ISA板中。洗涂后， 加入兔mAb上清液（1:5)，并使用山羊抗兔IgG轻链（1:5000)HRP缀合物检测兔mAb的结 合。如图5所示，YP187、YP223、YP218和YP3识别不同于SS1P位点的位点。除了YP187,所 有其它的兔mAb灯P223、YP218和YP3)都W剂量依赖的方式结合间皮素。YP187mAb抗体部 分地与SS1P竞争间皮素，运表明YP187位点（在区域II中）可能接近在区域I中的SS1P 位点。
[0361] 运些结果表明，YP223(区域II)，YP218(区域III)和YP3(构象敏感性）兔mAb不 结合与MORAb-009/SSlP位点（区域I)重叠的表位。YP187 (区域II)mAb部分地与SS1P竞 争间皮素，表明在YP187位点可能接近区域I中SS1P位点。
[0362] 兔mAb克隆的结合亲和力
[0363] 通过化ISA评估YP223、YP218和YP3针对间皮素的结合亲和力。在室溫下将不同 含量的兔mAb与固定量的间皮素（1yg/mL)解育1小时，随后洗涂板并按照标准的化ISA 程序测量兔mAb对间皮素的结合。通过适用于Windows的PrismO. 02版本）（GraphPad software,SanDiego,CA)测定亲和力Kd值。如图6A-6C所示，所有的兔mAb对间皮素具 有高的亚纳摩尔的亲和力。具体地，YP223的Kd值为0. 65nM，YP218的KD值为0. 91nM，YP3 的Kd值为0. 42nM。
[0364] 接着，进行研究W评估使用兔mAb克隆进行的对培养物上清液中的可溶性间皮素 蛋白的检测。H9和K5细胞系广泛用于异种移植物模型，用于在小鼠中评价间皮素-祀向癌 症疗法。K5细胞系表达一种在区域II具有一个10-氨基酸缺失（411-420位残基）的形式 的间皮素，而H9细胞系表达全长、野生型间皮素。
[0365] 用SS1P巧yg/血）包被ELISA板。加入H9或K5培养物上清液（1:3系列稀释）。 洗涂后，加入兔mAb培养物上清液（1:5)。使用山羊抗兔轻链-特异性HRP缀合物（1:5000) 检测兔mAb的结合（图7A-7B)。
[036引区域II、区域m和构象敏感性mAb结合H9细胞系中的野生型间皮素。但是，区 域II灯P223)和区域IinYP218)mAb，而非构象敏感性灯P3)mAb，较弱地结合由K5细胞系 表达的具有一个10-氨基酸缺失的突变间皮素，但不是如此，运表明YP3识别野生型间皮素 的构象所特有的天然构象。
[0367] 通过S明治化ISA检测可溶性间皮素
[0368] 使用在口85中的5^邑/1111的￥口223(区域11结合物）过夜包被伽11〇]\&?13〇巧96 孔平底板。使用ELISA缓冲液0). 01 %的吐溫20,10%的PierceSuperBlock)将纯化的间 皮素-Fc融合蛋白稀释为不同浓度（从0. 25至8nM)，并在室溫下在平板上解育1小时。对 于SS1P竞争实验，在室溫下，将5yg/mLSS1P与间皮素-Fc融合蛋白预解育1小时，然后将 混合物（SS1P和间皮素）加到板中。为了检测可溶性间皮素，随后将所述板用5yg/mL生 物素化的YP218(区域III结合物）在室溫下解育1小时；随后将1:2000稀释的链霉亲和 素-HRP(Invitrogen)加在板上，在室溫下持续1小时。在每次包被之间将板洗涂四次。使 用3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺检测试剂（KPL)实现可视化，并且使用SpectraMaxPlus板 读数器（MolecularDevices)读取450皿处的吸光度。结果如图10所示。
[0369] 运些结果表明了建立了一种新的在SS1P免疫毒素的存在下使用YP223和YP218 兔抗体测量可溶性间皮素蛋白的S明治化ISA方法。SS1P的存在不影响YP223或YP218与 间皮素的结合。运种新的S明治ELISA测定是高度灵敏的，因为（1)它的ECw约为0. 5nM， 并且（2)它可W检测0. 2nM的可溶性间皮素蛋白。
[0370] 实施例2 :特异性针对间皮素区域I的高亲和力兔mAb
[0371] 本实施例描述了W高亲和力和特异性结合癌症细胞和组织中的天然间皮素的区 域I的兔mAb克隆的鉴定和表征。
[0372] 如实施例1所述，鉴定了 223个结合间皮素区域I(第296-390位残基）的兔mAb 克隆。在该组中的高亲和力结合物中，鉴定出YP158。YP158对肿瘤细胞和组织中的间皮素 具有高度特异性。
[0373] 为了评估YP158与人癌细胞的结合，进行使用一组肝癌细胞系和癌症样品的免疫 印迹分析。如图8A-8B所示，YP158能够检测肿瘤细胞中的天然间皮素。随后评价YP158检 测免疫沉淀复合物中的天然间皮素的能力。在该实验中，对A431/H9(在表皮样癌A431细 胞系中强制表达（forcedexpression)间皮素）、NCI-肥26 (间皮瘤）和KMBC(胆管癌）细 胞提取物中的内源性间皮素蛋白进行免疫沉淀。使用针对间皮素的人mAb免疫沉淀细胞裂 解物中的内源性间皮素蛋白。使用YP158探测在免疫沉淀蛋白中的天然间皮素（图9)。
[0374] 运些结果表明，YP158W非常高的亲和力和特异性结合癌症细胞和组织中的天然 间皮素蛋白。
[0375] 实施例3 :CD22特异性免疫毒素的生成与表征
[0376] 按照标准技术，使用融合至假单胞菌外毒素片段阳38(SEQIDN0:2)的YP3、 YP218、YP223和YP187scFv生成重组免疫毒素。简言之，在每个免疫毒素构建体中，利用编 码肤（Gly4Ser)3(SEQIDN0:31的第125-139位氨基酸残基）的接头序列，使抗体VH结构 域融合至化结构域。使用短接头序列（ASGG;SEQIDNO: 31的第251-254位氨基酸残基） 使抗体化结构域融合至阳38。YP218scFv-PE38、人源化YP213scFv-PE38、YP223scFv-PE38、 YP3scFv-PE38和YP187scFv-PE38免疫毒素的核巧酸和氨基酸序在本文中列示出为SEQID NO:30-39。
[0377]通过流式细胞术评估YP3scFv-PE38、YP218scFv-PE38 和YP223scFv-PE38 免疫毒素针对一组表达间皮素的肿瘤细胞的结合亲和力。还评估了YP3scFv-PE38、 YP218scFv-PE38和YP223scFv-PE38免疫毒素对表达间皮素的肿瘤细胞的细胞毒性。使用 间皮素特异性免疫毒素SS1P作为阳性对照，使用皿21-PE40免疫毒素（特异性针对人转铁 蛋白受体）作为阴性对照。结果总结于下表6中。所有3种免疫毒素W不同的亲和力结合 间皮素阳性细胞系，其中YP218scFv-PE38表现出最高的亲和力。YP218scFv-PE38还诱导了 最高的针对表达间皮素的肿瘤细胞的细胞毒性。
[037引表6,抗间皮素免疫毒素针对表达间皮素的细胞的细胞毒性和亲和力的总结
[0379]
[0380]
[0381] *间皮素阴性
[0382]此外，通过流式细胞术评价了YP3scFv-PE38、YP187scFv-PE38、YP218scFv-PE38 及其人源化形式hYP218scFv-PE38和YP223scFv-PE38对H9细胞的结合亲和力。结果示出 于图11，并总结于下表7。YP218scFv-阳38免疫毒素的人源化没有显著改变其对间皮素阳 性H9细胞的结合亲和力。
[0383] 表7.免疫毒素对H9细胞的结合亲和力
[0384]
[038引然后，将YP218scFv-PE38针对4种恶性间皮瘤患者原代细胞系的细胞毒性与SS1P免疫毒素的细胞毒性进行比较。在所述4种原代细胞系（RH16、RH18、RH19和R肥1) 中，3种对抗-间皮素免疫毒素敏感。在所述3种敏感的原代系（RH16、RH19和R肥1)中， YP218scFv-PE38的效力是SS1P的2至5倍（见图12和表8)。
[0386] 表8.YP218scFv-PE38对4种间皮瘤患者原代细胞系的细胞毒性
[0387]
[038引
[0389] 在裸鼠的NCI-肥26人间皮瘤模型中对YP218scFv-PE38进行进一步评估。对 6周的雌性BALB/cnu/nu小鼠腹膜内接种3X1〇6个稳定表达高水平的Luc/GFP的 NCI-肥26间皮瘤细胞。在第12、14、16和18天对小鼠腹膜内给予SS1P化4mg/kg)、 YP218scFv-PE38(0. 4mg/kg)或载体（PBS)。SS1P和YP218-阳38免疫毒素在治疗过程中 有效地抑制了肿瘤的生长。然而，在SS1P的治疗完成后残留的间皮瘤肿瘤细胞很快引起 复发，而YP218scFv-阳38组的间皮瘤复发显著性地更慢（图13)。在第25天和第27天， YP218scFv-PE38组的5只小鼠中的2只几乎没有肿瘤，而SS1P组中的所有小鼠都有肿瘤。
[0390] 实施例4 :间皮素特异性单克隆抗体用于检测受试者中的癌症或确认受试者中的 癌症的诊断
[0391] 本实施例描述了间皮素特异性单克隆抗体用于检测受试者中的癌症的用途，所述 间皮素特异性单克隆抗体例如本文公开的兔单克隆抗体或运些抗体的人源化或标记的形 式。本实施例进一步描述了运些抗体用于确认受试者中的癌症的诊断的用途。
[0392] 从诊断患有或怀疑患有间皮素-阳性癌症（即过表达间皮素的癌症，如间皮瘤， 前列腺癌，肺癌，胃癌，鱗状细胞癌，膜腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌）的患者获得血液样 品。来自未患有癌症的患者的血液样品用作对照。进行化ISAW检测所述血液样品中可 溶性间皮素的存在。按照本领域公知的方法将存在于所述血液样品（患者样品和对照样 品）中的蛋白质固定在固体载体如96孔板上（参见，例如Robinsonetal.，Lancet362: 1612-1616,2003)。固定后，将直接用巧光标记物标记的间皮素特异性单克隆抗体施加到所 述固定蛋白的板上。在合适的缓冲液（例如PB巧中洗涂板，W除去任何未结合的抗体，并 且最小化抗体的非-特异性结合。可W根据标准方法使用巧光板读取器来检测巧光。患者 样品的巧光强度相对于对照样品增加，表明所述抗间皮素抗体特异性结合来自血液样品的 蛋白质，从而检测到样品中间皮素蛋白的存在。在患者样品中检测到间皮素蛋白表明所述 患者患有间皮素-阳性癌症，或确认所述受试者中的癌症的诊断。
[0393] 实施例5 :间皮素特异性单克隆抗体用于治疗癌症
[0394] 本实施例描述了间皮素特异性单克隆抗体（如本文公开的兔单克隆抗体或运些 抗体的人源化形式）用于治疗表现出间皮素过表达的癌症（在本文中被称为"间皮素-阳 性"癌症）的用途，所述癌症包括但不限于间皮瘤，前列腺癌，肺癌，胃癌，鱗状细胞癌，膜腺 癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。被诊断为患有间皮素-阳性癌症的患者可W根据本领域的 标准程序进行治疗（参见例如，化ssanetal.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol. 21 :29a，2002 ;Kreimanetal.，Proc.Am.Soc.ClinlOncol. 21 :22b，2002)。
[0395] 在本实施例中，给予被诊断患有间皮素-阳性癌症的患者包含连接至假单胞菌外 毒素（P巧的间皮素特异性单克隆抗体的免疫缀合物。PE免疫缀合物的制备已经有所记载 (参见，例如美国专利No. 7, 081，518和美国专利申请公开文本No. 2005/0214304)。在一 些患者中，通过静脉快速注射每隔一日给予所述免疫缀合物，共=至六个剂量。在其他患 者中，通过在十天的时间内连续静脉输注给予所述免疫缀合物。给予患者的免疫缀合物的 剂量取决于所述患者的体重和性别W及给药的方式和时程。治疗后，评估患者的癌症进展 (包括肿瘤生长和转移）和疾病的其他临床征象。
[0396] 考虑到所公开的本发明的原理所适用的许多可能的实施方案，应当认识到，所举 例的实施方案只是本发明的优选实例，并且不应当被认为是对本发明范围的限制。相反，本 发明的范围由W下的权利要求书确定。所W，本发明人要求保护落入运些权利要求的范围 和主旨内的所有发明。
【主权项】
1. 一种结合间皮素的分离的单克隆抗体，其中： (i) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 13的第27-34, 52-59和98-112位氨基酸残 基；并且所述抗体的VL结构域包含SEQIDNO: 15的第27-32, 50-52和89-101位氨基酸残 基； (ii) 所述抗体的重链可变区（VH)结构域包含SEQIDN0:9的第27-34,52-59和 98-111位氨基酸残基；并且所述抗体的轻链可变区（VL)结构域包含SEQIDNO: 11的第 27-32, 50-52和89-100位氨基酸残基； (iii) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 17的第26-33, 51-58和97-108位氨基酸 残基；并且所述抗体的VL结构域包含SEQIDNO: 19的第27-32, 50-52和89-100位氨基酸 残基； (iv) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 21的第25-33, 51-57和96-113位氨基酸 残基，或者SEQIDNO:29的第26-34, 52-60和98-112位氨基酸残基；并且所述抗体的VL 结构域包含SEQIDNO: 23的第27-32, 50-52和89-100位氨基酸残基；或 (iv)所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 25的第25-33, 51-59和97-109位氨基酸 残基；并且所述抗体的VL结构域包含SEQIDNO: 27的第27-32, 50-52和89-102位氨基酸 残基。2. 权利要求1的分离的单克隆抗体，其中： (i) 所述VH结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 13至少90%或至少95%相同；并且所 述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 15至少90%或至少95%相同； (ii) 所述VH结构域的氨基酸序列与SEQIDN0:9至少90%或至少95%相同；并且所 述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 11至少90%或至少95%相同； (iii) 所述VH结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 17至少90%或至少95%相同；并且 所述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 19至少90%或至少95%相同； (iv)所述VH结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 21或SEQIDNO: 29至少90%或至 少95%相同；并且所述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 23至少90%或至少95%相 同；或 (V)所述VH结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 25至少90%或至少95%相同；并且所 述VL结构域的氨基酸序列与SEQIDN0:27至少90%或至少95%相同。3. 权利要求1或权利要求2的分离的单克隆抗体，其中： (i) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 13并且所述抗体的VL结构域包含SEQID NO:15 ； (ii) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO:9并且所述抗体的VL结构域包含SEQID NO:11 ； (iii) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 17并且所述抗体的VL结构域包含SEQID NO:19 ； (iv) 所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 21或SEQIDNO: 29,并且所述抗体的VL 结构域包含SEQIDNO:23;或 (V)所述抗体的VH结构域包含SEQIDNO: 25并且所述抗体的VL结构域包含SEQID N0:27〇4. 一种结合间皮素的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含： (i)VH结构域，其包含SEQIDN0:9、SEQIDN0:13、SEQIDN0:17、SEQIDN0:21、SEQ IDNO:29或SEQIDNO:25的氨基酸序列； (ii)VL结构域，其包含SEQIDN0:11、SEQIDN0:15、SEQIDN0:19、SEQIDN0:23 或 SEQIDNO:27的氨基酸序列；或 (iii) 同时⑴和（ii)。5. 权利要求1-4任一项的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是Fab片段、Fab'片段、 F(ab)'2片段、单链可变片段（scFv)或二硫键稳定的可变片段（dsFv)。6. 权利要求1-4任一项的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是IgG。7. 权利要求1-6任一项的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是嵌合的、合成的或人源 化的。8. 权利要求1-7任一项的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是经标记的。9. 权利要求8的分离的单克隆抗体，其中所述标记是荧光标记、酶标记或放射性标记。10. -种分离的免疫缀合物，其包含权利要求1-7任一项的单克隆抗体和效应分子。11. 权利要求10的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子是毒素。12. 权利要求11的分离的免疫缀合物，其中所述毒素是假单胞菌（Pseudomonas)外毒 素或其变体。13. 权利要求12的分离的免疫缀合物，其中所述假单胞菌外毒素或其变体包含SEQID NO: 1-6中任一个的氨基酸序列。14. 权利要求9-13任一项的分离的免疫缀合物，其包含SEQIDNO: 31、SEQIDNO: 33、 SEQIDNO:35、SEQIDNO:37 或SEQIDNO:39 的氨基酸序列。15. -种组合物，其包含在可药用载体中的治疗有效量的权利要求1-9任一项的抗体 或者权利要求10-14任一项的免疫缀合物。16. -种治疗受试者中的癌症的方法，包括选择患有表达间皮素的癌症的受试者并给 予所述受试者权利要求1-9任一项的分离的单克隆抗体，权利要求10-14任一项的免疫缀 合物或者权利要求15的组合物，从而治疗所述受试者中的癌症。17. -种抑制受试者中的肿瘤生长或转移的方法，包括选择患有表达间皮素的癌症的 受试者并给予权利要求1-9任一项的分离的单克隆抗体，权利要求10-14任一项的免疫缀 合物或者权利要求15的组合物，从而抑制所述受试者中的肿瘤生长或转移。18. -种确定受试者是否患有癌症的方法，包括： 将来自所述受试者的样品与权利要求1-9任一项的单克隆抗体接触； 检测所述单克隆抗体与所述样品的结合；和 如果与所述单克隆抗体与对照样品的结合相比，检测到所述抗体与所述样品的结合增 加，则确定所述受试者患有癌症。19. 一种确认受试者中的癌症的诊断的方法，包括： 将来自被诊断患有癌症的受试者的样品与权利要求1-9任一项的单克隆抗体接触； 检测所述单克隆抗体与所述样品的结合；和 如果与所述单克隆抗体与对照样品的结合相比，检测到所述抗体与所述样品的结合增 加，则确认所述受试者中的癌症的诊断。20. 权利要求16-19任一项的方法，其中所述癌症是间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鱗 状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌或卵巢癌。21. -种分离的核酸分子，其编码权利要求1-9任一项的单克隆抗体或者权利要求 10-14任一项的免疫缀合物。22. 权利要求21的分离的核酸分子，其中： (i) 编码所述单克隆抗体的VH结构域的核苷酸序列包含SEQIDNO:12、SEQIDNO:8、 SEQIDNO:16、SEQIDNO:20、SEQIDNO:28 或SEQIDNO:24; (ii) 编码所述单克隆抗体的VL结构域的核苷酸序列包含SEQIDN0:14、SEQIDN0:8、 SEQIDNO:18、SEQIDNO:22 或SEQIDNO:26;或 (iii) 同时⑴和（ii)。23. 权利要求21或22的分离的核酸分子，其中编码所述免疫缀合物的核苷酸序列包含 SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36 或SEQIDNO:38。24. 权利要求21-23任一项的分离的核酸分子，可操作地与启动子连接。25. -种表达载体，其包含权利要求21-24任一项的分离的核酸分子。26. -种分离的宿主细胞，其是用权利要求21-25任一项的分离的核酸分子或表达载 体转化的。
【专利摘要】本文所述的是利用兔杂交瘤技术以及一组截短的间皮素结构域片段，以确定结合间皮素特异区的抗间皮素的mAb。在本发明公开内容的一个方面中，兔的mAb结合不是区域I的一部分的表位。具体地，所鉴别的mAb(YP187，YP223，YP218和YP3)以亚纳摩尔的亲和力结合间皮素的区域II(391-486)、区域III(487-581)或天然构象。这些抗体并不与间皮素特异性免疫毒素SS1P或间皮素特异性抗体MORAb-009竞争结合。在另一方面，本发明公开的是一种结合间皮素的区域I的高亲合力的兔mAb(YP158)。YP158以高亲和力和特异性结合肿瘤细胞和组织中的天然间皮素蛋白质。
【IPC分类】A61K47/48, C07K16/30
【公开号】CN105026429
【申请号】CN201380053870
【发明人】W·高, R·哈桑, M·何, I·H·帕斯坦, Y·T·冯, Y·张
【申请人】美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表)
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2013年8月16日
【公告号】CA2882753A1, EP2888282A1, US20150252118, WO2014031476A1