为IfepG2.2.15细胞株，购自中山大学医学院。实验试剂为HBsAg (乙型肝炎表面抗原)和HBeAg (乙型肝炎E抗原)酶联免疫检测试剂盒(ELISA，上海荣盛生物技术有限公司)；MEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；卡那霉素(Amreso公司)；胰蛋白酶(Amreso公司)、3_ (4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Serva公司)；二甲基亚讽(DMSO)(美国Sigma公司)；G418 (美国Sigma公司)。
[0048]4.1细胞培养
H印G2.2.15细胞用含15%胎牛血清、0.03% L-谷氨酰胺、G418 380 yg /mL、卡那霉素50 U/mL，pH为7.2的MEM培养液常规培养。取对数生长期的H印G2.2.15细胞，通过稀释调整细胞浓度为5 X 14个/mL。
[0049]4.2细胞毒性MTT试验
细胞接种于96孔板培养24 h后，加入用完全培养液将侧柏叶多糖稀释成1000，500，250，125，62.5 μ g/mL的应用液100 μ L，连续培养72 h，每孔加入MTT ;继续孵育4 h后，吸弃上清液并加入DMS0，震荡使结晶紫完全溶解。全自动酶标仪(检测波长490 nm)读取各孔OD值。
[0050]4.3 ELISA (酶联免疫吸附试验)法定量检测HBsAg和HBeAg
细胞接种于24孔板培养24 h后，分别加入用完全培养液将侧柏叶多糖稀释成1000，500，250，125，62.5 μ g/mL的应用液，每个质量浓度设3个复孔；以拉米夫定(3-TC，20 μ mol/L)为阳性对照药。连续培养72h后吸出上清液，按照ELISA试剂盒说明书，用酶标仪进行检测，读取450 nm波长下的吸光度值。图5为不同浓度侧柏叶多糖PPl对H印G2.2.15细胞毒性的MTT图，结果表明62.5 ~ 1000 μ g/mL的侧柏叶多糖PPl样品无明显细胞毒性。图6和图7分别为不同浓度侧柏叶多糖PPl对IfepG 2.2.15细胞HBeAg、HBsAg分泌量的影响。当样品浓度超过500 μ g/mL时，细胞的HBeAg分泌量显著降低，而且呈现明显的剂效关系；当样品浓度超过250 yg/mL时，细胞的HBsAg分泌量显著降低，而且呈现明显的剂效关系。说明侧柏叶多糖PPl在一定浓度下可以有效地抑制IfepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg，具有良好的抗病毒活性。
[0051]5、侧柏叶多糖的免疫活性测定
实验细胞为小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中山大学医学院。实验试剂包括:杜尔伯科极限必需培养基(DMEM)、链霉素和青霉素购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；N0检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠11-6 ELISA试剂盒、小鼠TNF-a ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。
[0052]5.1细胞培养
小鼠巨噬细胞RAW264.7用杜尔伯科极限必需培养基(DMEM)进行培养，并且加入10%的胎牛血清(FBS)、100 μ g/mL的链霉素和100 U/mL青霉素，放入37 ° (:、5%0)2培养箱中静置培养。取对数生长期小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过稀释将细胞浓度调整为5 X 14个/mL，接种于96孔板中，孵育24 h更换一次培养液。
[0053]5.2细胞毒性MTT试验细胞接种于96孔板培养24 h后，吸除全部培养液，加入用完全培养液将侧柏叶多糖稀释成1000，500, 250，125，62.5 μ g/mL的应用液100 μ L，连续培养72 h，每孔加入MTT ;继续孵育4 h后，吸弃上清液并加入DMSO，震荡使结晶紫完全溶解，全自动酶标仪(检测波长490 nm)读取各孔OD值。
[0054] 5.3 NO、肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-6、IL-12分泌量的测定
试验设为调零组、实验组、对照组和阳性对照组。其中调零组不加细胞，加入100 μ L培养液；实验组、对照组和阳性对照组，每孔加入100 μ L细胞悬浮液。实验组分别加入62.5，125，250，500, 1000 μ g/mL五个浓度梯度的侧柏多糖PPl溶液100 μ L，阳性对照组中加入50 μ g/mL的脂多糖(LPS)药液100 μ L(药液和阳性对照均用不含血清培养基配制)，每个不同组分样本设平行的6个孔。图8为侧柏叶多糖PPl对RAW264.7细胞的细胞毒性MTT试验结果图，由图可知在62.5 ~ 1000 μ g/mL浓度范围内，侧柏叶多糖PPl对细胞存活率没有显著影响，即无明显细胞毒性。分别用NO检测试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠IL-6 ELISA试剂盒和小鼠IL-12 ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-12、IL_6、TNF_ α、NO的分泌量。对于不同浓度的侧柏叶多糖PPl样品，上清液中IL-12、IL-6、TNF-α、NO的含量分别如图9至图12所示。由图可知，侧柏叶多糖PPl在62.5 ~ 1000 yg/mL范围内，细胞上清液中IL-12、IL-6、TNF-a、N0的含量显著高于对照组(Control )，并且呈现剂量效应，随着多糖浓度的升高，IL-12、IL-6、TNF-a、NO的含量也升高。因此侧柏叶多糖PPl能显著提高小鼠巨噬细胞RAW264.7上清液中IL-12、IL_6、TNF- a、NO的含量，具有良好的增强免疫活性。
【主权项】
1.一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，以侧柏叶为原料，经过如下工艺制备:热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析分离纯化、透析、真空冷冻干燥。2.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)将侧柏叶在40~ 80 ° C下干燥2 ~ 8 h，然后用打粉机粉碎； (2)热水浸提2~ 6 h，料液比为1: 20 ~ 1: 40 g/mL，热水温度为60 ~ 100 ° C，浸提次数为I ~ 3次； (3)采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理10~ 12次，收集上层多糖溶液然后进行浓缩和干燥； (4)往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入乙醇溶液，于O~ 4 ° C下静置过夜；然后进行高速离心，收集沉淀物，真空冷冻干燥后得到侧柏叶粗多糖； (5)采用离子交换柱层析对冻干后的侧柏叶粗多糖进行纯化，收集侧柏叶多糖洗脱峰浓缩后进行透析，然后真空冷冻干燥得侧柏叶多糖样品。3.根据权利要求2所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述乙醇是体积分数为65% ~ 95%的乙醇或者是无水乙醇，乙醇的加入量为粗多糖溶液体积的2 ~ 5倍。4.根据权利要求2所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述采用离子交换柱层析分离纯化所用的填料为下列填料中的一种:DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE_52、Sepharose XL、CM_52、Q Sepharose Fast Flow、ANS Sepharose 4 Fast Flow、Q Sepharose Big Beads ;透析温度为 0 ~ 4。C，透析时间为 48 ~ 60 ho5.根据权利要求2所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述纯化是采用去离子水和浓度为0.05mol/L -0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱。6.由权利要求1所述制备方法制得的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖。7.权利要求6所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖在制备抗乙肝病毒、提尚免疫功能的保健食品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法。本发明公开的侧柏叶多糖是由侧柏叶主要经过热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析分离纯化后获得。本发明的侧柏叶多糖分子量均一、纯度高并且热稳定性好、制备工艺合理简单，并且易于实现工业化。本发明制备的侧柏叶多糖具有良好的抗病毒及免疫促进作用，可以作为乙型病毒性肝炎等疾病的辅助治疗药物或者作为具有提高免疫力作用的功能性保健食品。
【IPC分类】A61P31/20, A61K36/14, A61P31/12, A61P1/16, A61P31/18, C08B37/00, A61P37/04, A23L1/29, A61K31/715
【公开号】CN105061615
【申请号】CN201510449768
【发明人】任娇艳, 林泽华, 康小燕, 刘丹, 廖文镇
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月28日