一种基于稀有细胞检测egfr/cep7基因状态的方法及相关试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学诊断学，特别涉及肿瘤细胞的检测。更具体地讲，本发明涉及检测 癌症和评估患者的治疗方案的诊断方法。
【背景技术】
[0002] 循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell,CTC)指进入到血液循环中的肿瘤细胞， 其可由原发灶或转移灶脱落入血，亦可能在形成实体瘤病灶之前进入血液中。肿瘤细胞侵 入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数 存活下来，并在远端或原发组织及器官种植，进一步发展为转移灶，是导致肿瘤转移和复发 的最直接因素。
[0003]CTC作为一种可以代表原发肿瘤的"液体活检"样本，外周血标本易获取、创伤性 小、可反复采集，是临床检测更为理想的标本来源，可对肿瘤治疗进行实时全面监测。可有 效实现肿瘤复发预警，疗效及时评价以及肿瘤个体化治疗用药指导，目前CTC检测已广泛 运用于临床肿瘤患者的疗效实时评价、病情实时监测、耐药析因、预后判断中。
[0004]焚光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH)是一种细胞遗传学 技术，可以用来对核酸进行检测和定位。目前基于脱落稀有细胞的FISH技术一般为定性检 测，很难做到精准定量且保证其效果。究其根本原位在于目前适用于组织标本的FISH检测 方法及普通的脱落细胞学FISH检测方法，当数量级在0-100间的细胞涂片后，无法在着色 效果和有效保持细胞方面取得较好的平衡并保持较高的稳定性，更难以形成有效稳定定量 检测的成型产品。目前虽有相应专利阐述一种有效方法（US6, 524, 798)，但需极其高昂成 本的专用检测设备，无法在常规实验室完成这基于及少量稀有细胞、甚至是单细胞层面的 FISH检测工作。
[0005] 此前已描述了来自生物样品的肿瘤细胞、稀少细胞或其他生物实体的鉴定方法 (如中国专利【申请号】200810097889. 4、201310057307. 0)。此两步法要求有效富集以确保 在分析之前获取靶细胞，同时去除大量碎片和其他干扰物质，使得可通过成像技术进行细 胞检验。此方法以独特的阴性富集策略将免疫磁微粒与多密度离心方式、荧光原位杂交和 免疫荧光细胞化学分析组合起来，精确定量地检测几乎所有实体肿瘤类型中脱落至含血 液、胸/腹腔积液、尿液、脑脊液等多种生物体液标本中的稀有细胞（含CTC)。此组合方法 用于富集和计数血样中的染色体扩增型肿瘤细胞，因此提供了一种量度癌症的工具。
[0006]EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是上皮生长因子（EGF)细胞增殖和信 号传导的受体。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤 细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。
[0007] 易瑞沙对于既往接受过化学治疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者的疗效 显著。多项研究显示，EGFR基因扩增的患者，其靶向药物有效率达35%，疾病控制率达 70%，而不具有基因扩增的有效率仅为9. 8%。
[0008] 但是临床检测时，会由于例如已手术切除、患者主观意愿不胁从等诸多无法有效 获得肿瘤组织的情况，而存在以下局限性：
[0009] 1、作为有创性且受限于病灶位置的组织学检测，存在标本取材不易或无法取材等 局限性，且术后不能反复取材，导致组织取材无法提供实时性的监测信息。
[0010] 2、且受治疗的影响等，肿瘤细胞的分子信息有可能发生动态改变。如：有研究报 道，接受新辅助化疗的乳腺癌患者，在化疗前接受活检，并将结果与术后病理进行对照，发 现存在治疗前后EGFR表达不一致的情况。
[0011] 3、肿瘤组织异质性的存在以及单点活检造成的只是局部信息反映的现状，使得传 统组织学检测缺乏全面整体性的评价，如原发灶、多发转移灶信息的综合评价等。
[0012] 本发明在于提供了一种检测CTC或其他稀有细胞的同时对EGFR/CEP7的数量及比 值进行检测的方法。以获得更加全面的信息。本发明在分离获取血液中CTC(或其他稀有 细胞）的基础上，进行单细胞分子分析，检测EGFR表达情况，以此来从单细胞水平上，即时 地发现EGFR的分子信息，以便对患者的状态进行实时观察。
【发明内容】
[0013] 本发明提供一种检测CTC或其他稀有细胞的同时对EGFR/CEP7的数量及比值进 行检测的方法。直接帮助临床医师了解肿瘤患者实时的基因状态，以辅助预测生存情况并 拟定下一步治疗方案。本发明的方法包括以下全部及部分步骤：步骤1，从患者获得血液样 本或其他含有稀有细胞的体液样本，样本中包含CTC或其他稀有细胞与白细胞的混合细胞 群；
[0014] 步骤2,用缓冲液稀释样本，离心去除血浆，并回收CTC或其他稀有细胞；
[0015] 步骤3,用红细胞裂解液裂解，离心去除红细胞并回收CTC或其他稀有细胞；
[0016] 步骤4,用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同步骤3所得的回收细胞混 匀孵育，以使磁微粒同标的白细胞充分结合并形成磁微粒-白细胞混合体；
[0017] 步骤5,离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离，得到含有CTC或其他稀有 细胞及少量白细胞的混合细胞群；
[0018] 步骤6,使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法，测定EGFR/CEP7 的状态，同时进行CTC或其他稀有细胞的鉴别。
[0019] 本发明所述的方法，其中，步骤2所述缓冲液为一种与血液密度相近的缓冲液，含 有BSA、PBS等物质，pH7-8之间，能够保证去除血浆的同时，保护各种有核细胞。
[0020] 本发明所述的方法，其中，步骤3所述红细胞裂解液为一种红细胞裂解液，利用等 渗不等张的原理，裂解红细胞的同时，不会损伤其他有核细胞。
[0021] 如以下配方的裂解液：
[0022] NH4C1 82. 9g
[0023] KHC0310g
[0024] EDTAO. 37g
[0025] 加H20至1000ml(高压灭菌，4°C保存）
[0026] 或
[0027] 红细胞裂解液（Tris-MMCl):称取3. 735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris)I. 3g 加水溶解并稀释至500ml。0. 22 y m滤膜过滤除菌，4°C保存。
[0028] 本发明所述的方法，其中，步骤4所述包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒 为一种包被抗白细胞共同抗原抗体的链亲和素磁珠。能够最大量地、牢固地结合白细胞，利 于后续的分选处理。
[0029] 本发明所述的方法，其中步骤5所述离心介质为一种密度介于1. 070-1. 080之间 的密度梯度离心液，其中以1. 072最优，可以在去除结合磁珠的白细胞的同时，保存其他单 个有核细胞不丢失。
[0030] 本发明所述的方法，其中，步骤6所述使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的 方法，对CTC或其他稀有细胞进行CTC鉴别，同时测定EGFR/CEP7,方法如下：
[0031] (I)EGFR扩增型CTC :将标本置于荧光显微镜相应通道下观察，若发现多个EGFR信 号点分布（彡3个），且数目大于CEP7的信号点数，并且无⑶45抗原表达，则计为一个CTC 阳性细胞，且直接视该细胞为EGFR阳性细胞；
[0032] (2)染色体扩增型CTC :计数单个有核细胞CEP7信号数目，若大于等于3个信号点 且无⑶45抗原表达，则计为一个CTC阳性细胞；
[0033] (3) EGFR/CEP7-CTC总数目：记录所有EGFR扩增型及染色体扩增型CTC数目，总和 视为EGFR/CEP7-CTC总数目；
[0034] (4)EGFR基因扩增状态记录：在所有标本区域中若有明显且典型EGFR扩增，则记 为EGFR扩增；若无，则将所有CTC细胞内平均每个细胞核中EGFR信号数量、平均每个细胞 核中CEP7信号数量、平均每个细胞核中EGFR和CEP7信号比值的结果。
[0035] -种用于上述方法的试剂盒一，包括如下成分：
[0036]
[0037]
[0038] 其中，IOX、20X表示浓度，即该溶液为10倍/20倍的浓度。
[0039] 本发明所述的试剂盒制备方法如下：
[0040] 试剂盒一包含下述富集及鉴别两部分的试剂。
[0041] 富集部分：
[0042] CSl浓缩缓冲液（IOX):
[0043] 每1000 mL水中，含有 60gBSA，5 包PBS粉末（2L/包），100mL0.5M的EDTA，0.8mL Proclin300。
[0044] CS2浓缩储存液（IOX):
[0045] 每1000 mL水中，称取 82. 9gNH4Cl、10gKHC03、0. 37gEDTA，水以及 0? 8mL Proclin300,进行充分的搅拌溶解，定容，配制为IOX浓缩液。
[0046] CS3分离介质：
[0047] 将密度为1. 077的梯度离心液稀释，稀释过程中测试密度，使其密度在 1. 070-1. 075 之间。
[0048] 磁微粒混悬液：
[0049] 将CD45抗体浓度调整为lmg/mL，与链亲和素免疫磁珠按照IOOuL:ImL的比例进行 孵育lh，即配制为磁微粒混悬液。
[0050] 鉴别部分：
[0051] CFl固定液：
[0052] 混合PEG和无水乙醇，使PEG终浓度为1 %，无水乙醇终浓度为50 %。
[0053] 10XCF2 固定液：
[0054] 以PBS为溶剂，溶解PFA粉末，配制为5 %的PFA浓缩液。
[0055] 甲酰胺工作液：
[0056] 将甲酰胺原液稀释为50%的工作液。
[0057] 20XSSC浓缩缓冲液：
[0058] 1000 mL水中，加入氯化钠175. 3g，柠檬酸铵88. 2g。