针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及志贺氏菌分子检测，尤其涉及针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时 荧光PCR检测引物和探针、检测方法及试剂盒，属于福氏志贺氏菌的检测领域。
【背景技术】
[0002] 志贺氏菌在世界许多国家和地区引发主要的健康问题，特别在不发达国家和发展 中国家由于缺乏清洁的水源、缺少必要的卫生医疗设备等诸多因素，导致志贺氏菌引发的 公共健康问题更加严重。志贺氏菌主要通过消化道途径传播，侵袭肠上皮细胞，引起以发 热、腹痛、腹泻为特征的典型的痢疾症状，严重危害人类健康，特别是营养不良的儿童和免 疫缺陷病患者最易感，传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经 口感染，人类对志贺氏菌易感。世界范围内，志贺氏菌病在1~5岁或更大一点幼儿中发病 率和致死率最高。在成年患者中，10~100CFU志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发严重 的炎症反应。大多数志贺氏菌病与三种志贺氏菌息息相关，即福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏 菌和痢疾志贺氏菌。其中，福氏志贺氏菌（Shigellaflexneri，S.flexneri)主要在发展中 国家被发现，是引起急性感染性腹泻最主要的病原体之一，少至10个细菌即可引起感染。 该菌毒素毒性强烈，可引起脓血粘液便、发热、神志障碍、中毒性休克等一系列毒血症症状， 甚至危及生命。
[0003] 近年来，由于多重耐药志贺氏菌株的出现，使得世界范围内许多国家和地区 志贺氏菌病例数量增加，早期确诊志贺氏菌病需要准确快速的检测技术。目前，在发 展中国家由于缺乏准确可靠的鉴定技术，大多数志贺氏菌都无法鉴定分群，对志贺氏 菌的鉴定分群主要依靠常规生化鉴定方法、免疫学方法，这些方法比较复杂、耗时耗 力、敏感性低。分子生物学检测方法是近几年来发展起来的快速检测方法，是目前检 验检疫系统推广使用的检验检疫手段之一。目前，国内外有许多作者建立了食品中 志贺氏菌属的PCR检测方法，如国外S.Dutta等（S.Dutta,A.Chatterjee,P.Dutta etal.,"SensitivityandperformancecharacteristicsofadirectPCRwith stoolsamplesincomparisontoconventionaltechniquesfordiagnosisof ShigellaandenteroinvasiveEscherichiacoliinfectioninchildrenwithacute diarrhoeainCalcutta,India,'，JournalofMedicalMicrobiology,vol. 50,no. 8, 卩卩.667 _ 674,2001.)和11〇111^113 11(}1.3.11.11〇111^，0.361:11&13111：1'，&11(1?.￡。116￥61'1'1&，"八 simplepolymerasechainreactiontechniquetodetectanddifferentiateShigella andenteroinvasiveEscherichiacoliinhumanfeces,jDiagnosticMicrobiologyand InfectiousDisease,vol. 28,no. 1，pp. 19 - 25, 1997.)建立的志贺氏菌属的PCR检测方 法，但这些方法存在一定的局限性而导致错检和漏检现象。在中国，许龙岩等（许龙岩，李 志勇，王志强，等.PCR方法检测志贺氏菌的研究.检验检疫科学，2003, 13 (5) : 28-29.)、 蔡亦红（蔡亦红.PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立.中国人兽共患病学 报，2008, 24 (2) :150-153.)、邱杨等（邱杨，唐丽霞，赵丽，等.志贺氏菌实时荧光PCR检 测试剂的研制.现代食品科技，2008, 24(11) : 1151-1154.)等建立的食品中PCR检测方法 的均只鉴定到志贺氏菌属。因此，建立一种准确可靠的、快捷的福氏志贺氏菌鉴定方法显得 尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一组针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时 荧光PCR检测引物对及探针；
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌 的实时荧光PCR方法；
[0006] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌 的实时荧光PCR检测试剂盒。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 本发明根据志贺氏菌rfc基因设计引物和探针。本发明首先公开了针对rfc基因 鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测的引物对和探针，其中引物对由核苷酸序列为SEQ IDNo. 1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 2所示的下游引物组成；所述探针的 核苷酸序列为SEQIDNo. 3所示；或者，
[0009] 所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo. 4所示的上游引物和核苷酸序列为SEQID No. 5所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 6所示；或者，
[0010] 所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo. 7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQID No. 8所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 9所示。
[0011] 本发明还根据ompA基因设计3对引物和探针作为内参照，所述内参照引物对由核 苷酸序列为SEQIDNo. 10所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 11所示的下游引物 组成，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 12所示；或者，所述内参照引物对由核苷酸序列 为SEQIDNo. 13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 14所示的下游引物组成，所 述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 15所示；或者，所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQ IDNo. 16所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 17所示的下游引物组成，所述探针的 核苷酸序列为SEQIDNo. 18所示。
[0012] 上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列 的互补链序列，同时还可以向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得 到的序列。
[0013] 本发明用17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌对福内氏志贺氏菌的实时荧光PCR检 测方法所用的引物和探针进行了特异性实验，结果表明，引物对和探针Flexl-F/Flexl-R/ Flexl-P(即由SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQID No. 3所示）特异性好，仅在福内氏志贺氏菌出现S型扩增曲线，在一些其它志贺氏菌（如宋 氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌）和非志贺氏菌均未出现S型扩增曲线。内参照 引物和探针(：廿1-卩/(：廿1-1?/(：廿1-?(即由5￡〇10吣.10和5￡〇10吣.11组成的引物对 ； 探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 12所示）在所有细菌中均能够出现扩增曲线。
[0014] 而引物和探针Flex2-F/Flex2-R/Flex2-P(即由SEQIDNo. 4 和SEQIDNo. 5 组 成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 6所示）、Flex3-F/Flex3-R/Flex3-P(即由SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 9所示）以 及内参照引物和探针(：廿2-卩/(：廿2-1?/(：廿2-?(即由5￡〇10吣.13和5￡〇10吣.14组成的 引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 15所示）、Ctr3-F/Ctr3-R/Ctr3-P(即由SEQID No. 16和SEQIDNo. 17组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 18所示）的实时 荧光PCR特异性不好。
[0015] 因此，本发明选择引物和探针Flexl-F/Flexl-R/Flexl-P(即由SEQIDNo. 1和 SEQIDNo. 2组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 3所示）用于鉴定福氏志贺氏 菌，以引物和探针Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P作为内参照（即由SEQIDNo.10和SEQIDNo. 11 组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 12所示）。
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