一种植物线粒体dna的快速提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物线粒体DNA的快速提取方法。
【背景技术】
[0002]线粒体是植物细胞的重要细胞器，它是自身具有一定遗传功能结构的基因组，能够自我复制，可编码一些呼吸代谢过程中的重要酶成分，为细胞生理活动提供能量。线粒体作为细胞能量代谢和物质转化的中枢，在细胞合成、物质转运及信息传递中起着重要作用。另外，对许多高等植物细胞质雄性不育研究表明，线粒体与细胞质雄性不育有密切关系，是雄性不育因子的重要载体。研究线粒体DNA(mtDNA)的结构与功能，对作物改良，探索细胞器的起源和进化，特别在植物细胞质雄性不育的研究、不同雄性不育的细胞质分类上有重要的意义。
[0003]提取尚质量的线粒体DNA是对线粒体遗传系统进彳丁深入研究的基本如提。植物线粒体DNA与核DNA相比，在细胞内含量甚微，提取过程中极易被核及叶绿体DNA污染。另夕卜，植物mtDNA大多数为环状分子，每个线粒体中DNA分子数从几拷贝到几十拷贝不等，且不同物种mtDNA分子大小差别很大，从几十kb到几千kb不等，所对应的mtDNA提取方法也不同。总体来看，植物mtDNA提取方法，主要有密度梯度离心和差速离心等方法。密度梯度离心得到的线粒体DNA纯度高，但操作复杂、耗时、对材料的需求量大、产率低；普通差速离心操作简单，但所提取的mtDNA纯度低，易降解，核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染严重。这些不利因素的制约导致现有的线粒体提取方法不能满足后续研究工作的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种植物线粒体DNA的快速提取方法，该方法能高效、简单、快速得获得高质量的线粒体DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。
[0005]本发明的技术方案是:一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，具体包括下述步骤:
[0006](I)溶液配制
[0007]Buffer Α:0.4Μ 蔗糖，5mM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl，1mM 三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1% BSA(牛血清白蛋白)和I % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 7.8 ;
[0008]Buffer B:0.4M 蔗糖，ImM EDTA, 1mM Tris-HCl，0.1% BSA, ρΗ7.2 ；
[0009]溶液Wl:1%葡萄糖，50mM EDTA，25mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ；
[0010]溶液W2:0.2mM NaOH，I % SDS (十二烷基硫酸钠);
[0011 ]溶液 W3:5mol/L KAC (醋酸钾)，ρΗ4.8 ；
[0012]漂洗液WT:70%酒精；
[0013]洗脱缓冲液TB:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, PH = 8.0 ；
[0014]备注:其中，70%酒精的百分数为体积比，其余百分数均为质量体积比w/v(即g/ml) ο
[0015]⑵预处理
[0016]取植物新鲜幼嫩组织于4°C环境中暗处理24h，在预冷(预冷至2-4°C )的蒸馏水中清洗材料[若需消毒，在终浓度为0.7% (w/v)的次氯酸钠稀释液中浸泡5min];材料预处理后立即进行提取，以避免细胞膨胀压力及获得最大量的线粒体，下述步骤均需在2-4°C下进行；
[0017]⑶研磨
[0018]在预冷的研钵中加入Buffer A，再加入预处理的材料进行研磨；研磨后通过4_8层的医用纱布过滤，收集过滤液并保持其pH在7.0以上(若不足，用NaOH调整)；
[0019](4)分离线粒体
[0020]将收集液于4°C，100g离心5± lmin，收集上清；4°C，12000g离心20±2min，弃掉上清；加入Buffer B，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；然后4°C，100g离心5± lmin，收集上清 MADNase I，放置 l_2h ;加入 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)，混匀后静止 10±2min，终止反应-A°C，12000g离心20±2min，弃掉上清；
[0021](5)提取线粒体DNA
[0022]向沉淀中加入溶液Wl悬浮沉淀；然后加入溶液W2，温和颠倒6-8次，再加入溶液W3，温和颠倒离心管，充分混匀溶液；离心10±2min，吸取上清放入吸附柱(带有核酸硅胶膜的硅胶膜离心吸附柱)中，再离心，倒掉废液；向吸附柱中先后2次加入漂洗液WT，离心漂洗吸附柱；最后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，离心2_3min，将溶液收集到离心管中，_20°C保存。
[0023]进一步地，所述步骤(3)所使用的Buffer A，若为非绿色组织，则比例为2ml/g ;若为绿色组织，4ml/g。
[0024]进一步地，所述步骤⑷的Buffer B用量为40ml/g(材料)；优选的，先加入Buffer B5-10ml/g，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；将重悬液转移到一个新的离心管中，加入Buffer B 至 40ml/g。DNase I 的用量为终浓度为 40 μ g/ml，0.5mol/L EDTA 的用量为 ImL/g (材料)。
[0025]进一步地，所述步骤(5)中离心的离心速度均为10000-15000g，优选为12000g。
[0026]进一步地，所述步骤(5)吸附柱放入一个干净的离心管中滴加洗脱缓冲液TB前，再 12000g 离心 2min。
[0027]进一步地，所述步骤(5)每Ig材料，采用2ml溶液Wl悬浮后，加入250 μ I溶液W2和350 μ I溶液W3。
[0028]本发明具有以下优点:
[0029]1、本发明Buffer A中鹿糖可以维持渗透压，EDTA提供二价阳离子，Tris-HCl提供缓冲区间，该配方可以为植物组织提供稳定的PH值和渗透压，最大程度保证植物细胞中线粒体的完整性；更重要的是Buffer A中加入三甲基甘氨酸和半胱氨酸，产率提高，线粒体DNA无明显降解；
[0030]2、材料研磨后保持PH7.0以上，产率和质量得到提高；
[0031]3、由于步骤(4)中Buffer B中加入0.1 % BSA,具有维持稳定pH值和渗透压的作用，故而产率和质量得到提高；
[0032]4、由于步骤(4)中离心力为1000g，可以更好的将细胞壁残留组织与粗线粒体分离开；
[0033]5、由于步骤(5)中使用溶液W1、W2、W3和吸附柱提取线粒体DNA，处理时间由4_5h变为30min，大大缩短实验时间，但产率和质量无明显变化。
[0034]综上，本发明能高效(提取效率由现有的0.1yg mtDNA/g组织提高一倍到0.2ygmtDNA/g植物组织)、快速(提取时间由6-7h缩短为3_4h)得获得高质量(凝胶电泳检测mtDNA为明亮清晰条带)的植物线粒体DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。
【附图说明】
[0035]图1为5个线粒体DNA凝胶电泳图；
[0036]图2为以两种方法提取的线粒体DNA为模板的PCR凝胶电泳对比图；其中，A1-A5为本发明所述提取方法得到的线粒体DNA扩增产物为传统方法(普通差速离心)提取的线粒体DNA扩增产物。
【具体实施方式】
[0037]实施例1
[0038](I)溶液配制
[0039]Buffer Α:0.4Μ 蔗糖，5mM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl，1mM 三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1% BSA(牛血清白蛋白)和I % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 7.8 ;
[0040]Buffer B:0.4M 蔗糖，ImM EDTA, 1mM Tris-HCl, 0.1% BSA, ρΗ7.2 ；
[0041]溶液Wl:1%葡萄糖，50mM EDTA，25mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ；
[0042]溶液W2:0.2mM NaOH, I % SDS (十二烷基硫酸钠);
[0043]溶液W3:5mol/L KAC (醋酸钾)，ρΗ4.8 ；
[0044]漂洗液WT:70%酒精；
[0045]洗脱缓冲液TB:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, PH = 8.0 ；
[0046](2)组织预处理:
[0047]取Ig萝卜新鲜幼嫩组织于4°C环境中暗处理24h，在预冷(预冷至2-4°C )的蒸馏水中清洗材料(若需消毒，在终浓度为0.7%的次氯酸钠稀释液中浸泡5min);
[0048](3)研磨:
[0049]材料一旦准备完毕需立即进行提取，以避免细胞膨胀压力及获得最大量的线粒体，所有步骤均需在2_4°C下进行，不要在大于4°C的环境中或延长步骤中的操作时间间隔。
[0050]在预冷的研钵中加入Buffer A，研磨材料；通过4_8层的医用纱布过滤匀浆，收集过滤液；最后通过挤压过滤用的纱布合并收集液于50ml的离心管中，均一化的滤液需要保持pH在7.0以上，若不足，用NaOH调整；所使用的Buffer A若为非绿色组织，则比例为2ml/g ;若为绿色组织，4ml/g ；
[0051](4)分离线粒体:
[0052]将收集液于4°C，100g离心5min，收集上清；然后4°C，12000g离心20min，弃掉上清；加入Buffer B 5_10ml，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；