菊花耐盐性关联分子标记及其获得方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及菊花耐盐性关联分子标记及其获得方法和应用。
【背景技术】
[0002] 菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.)原产中国，是菊科菊属多年生宿根草 本植物。菊花品种繁多，种质资源丰富，蕴含着丰富的遗传变异信息。土壤盐害一直是影响 农业生产的一个重要因素，设施栽培造成的次生性盐害也越来越多的受到人们的关注。切 花菊种植于温室大棚内，栽培管理过程中施用化肥但不能得到雨水的充分淋溶，加之土壤 表层水分不断地蒸发会造成设施土壤中盐分积累，影响切花菊根系对水、肥的吸收，最终导 致其生长发育受阻，降低品质。菊花耐盐性为复杂的数量性状，其遗传机制复杂。因此，了 解切花菊品种资源的多样性和亲缘关系，挖掘与耐盐性等数量性状紧密关联的分子标记有 利于开展相关性状优异等位基因位点挖掘和分子标记辅助选择育种。
[0003] 关联分析（连锁不平衡作图或关联作图）以连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD)为基础，以自然群体为研究对象，检测群体内目标性状与遗传标记或 候选基因的遗传变异的显著关联；可同时检测自然群体中的多个等位基因，利于在大量的 种质资源中鉴定对目标性状有正向贡献的优异等位基因。相比传统的QTL作图技术，关联 分析具有以下优点：（1)研究周期短，一般以自然群体为材料，无需构建专门的作图群体； (2)所用群体遗传基础广，可同时对同一基因座的多个等位基因进行分析；（3)定位精度 高，可达到单基因水平。利用自然群体在长期进化过程中所累积的重组信息，分辨率高，可 实现QTL的精细定位，甚至可直接定位到基因本身；(4)可以通过多年、多点试验去除环境 因子对性状统计的影响。
[0004] 土壤盐碱化是全球性问题，严重影响了生态环境和农业生产。目前我国菊花生产 基本上为分散型区域性生产，沿海和北方地区的盐渍土壤严重限制了菊花的栽培推广。因 此，提高菊花品种的耐盐性是菊花育种研究中的一个重要目标。然而目前关于菊花耐盐性 关联分子标记的精确定位和克隆还尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中菊花耐盐性优质基因的精确定位和克隆的研究在国内外几乎空 白这一现状，本发明通过筛选出多个与菊花耐盐性基因位点紧密关联的分子标记，从而建 立菊花耐盐性分子标记辅助选择体系，提高菊花优良耐盐性种质资源的选择效率，为菊花 新品种选育奠定基础。本发明的目的通过以下技术手段获得：
[0006] 一种菊花耐盐性关联分子标记的获得方法，包括以下步骤：
[0007]a、耐盐性鉴定：选取不同来源且无直接亲缘关系的若干个菊花品种，收集耐盐性 数据，对耐盐性数据进行基本描述性统计分析；
[0008]b、菊花品种群体结构分析：
[0009] 1)提取姻花品种的基因组DNA;
[0010] 2)随机选取菊花品种基因组DNA，对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛选，将 筛选出的扩增条带清晰、稳定且多态性丰富的引物组合用于菊花品种的全基因组分子标记 扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；
[0011] 3)对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异 源于某个群体的概率，并绘制出群体结构图；
[0012] c、菊花品种亲缘关系分析：根据三种标记的整合数据分析品种间的亲缘关系，得 到亲缘关系系数K矩阵；
[0013]d、与菊花耐盐性紧密关联的分子标记的确定：应用TASSEL5. 0软件中的混合线 性模型MLM进行耐盐性与分子标记的关联分析，将步骤b群体分析中所得到的各个品种的Q 值和步骤c亲缘关系分析中得到的K矩阵都作为协变量计入模型；以两年隶属函数值的平 均值作为耐盐性鉴定的表型数据联合以上分子数据进行关联分析，若P〈〇. 01，则认为该标 记位点是与菊花耐盐性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
[0014] 所述的耐盐性鉴定的具体方法优选为：选取不同来源且无直接亲缘关系的100个 以上的菊花品种，分别于连续两年春季采集供试菊花品种的脚芽扦插于穴盘中，待其生根 并生长至10叶龄苗时对其进行200mM/LNaCl盐处理，处理后3d、5d和7d观察不同品种幼 苗的受害情况，记录受害叶数（黄叶、萎蔫叶、干枯叶），评定盐害指数，盐害指数分为5级，1 级：植株基本无受害症状，叶片绿色、健康；2级：植株基本正常，下部叶片稍有黄斑或黑斑； 3级：植株有些灰暗无生气，下部有2-3片叶明显发黑或萎蔫；4级：植株有些萎蔫，下部4-5 片叶变黑且干枯萎蔫；5级：植株明显萎蔫，中下部叶均已变黑萎蔫或干枯。每个品种每个 时间点记录5个植株的萎蔫指数，取其算数平均值；用隶属函数法求出各品种的平均隶属 函数值&作为最终各品种的耐盐性鉴定数据，由于盐害指数与耐盐性成负相关，隶属函数 值Xi计算公式为：Xi= 1- (x-xmin) + (x_-xmin);
[0015] 公式中的X为某个品种某个指标的测定值，乂_和X_为所有品种该指标的最小值 和最大值；每个品种的最终隶属函数值为各个品种所有指标的隶属函数值的平均值，平均 隶属函数值越大，其耐盐性越强。
[0016] 所述的步骤3)优选运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进 行基于数学模型的类群划分，得到每个供试品种相应的Q值，即某个品种的基因组变异源 于某个群体的概率，并绘制出群体结构图；所述的步骤c:菊花品种亲缘关系分析：应用 SPAGeDi软件，根据三种标记的整合数据分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K矩 阵。
[0017] 所述的步骤d优选以两年隶属函数值的平均值作为耐盐性鉴定的表型数据，应用 TASSEL5. 0软件中的混合线性模型MLM进行耐盐性与分子标记的关联分析，若P〈0. 01，则认 为该标记位点是与菊花耐盐性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释 率R2。
[0018] 本发明所述的菊花耐盐性关联分子标记的获得方法，进一步优选包括以下步骤：
[0019]a、耐盐性鉴定：选取不同来源且无直接亲缘关系的100个以上的菊花品种，分 别于连续两年春季采集供试菊花品种的脚芽扦插于穴盘中，待其生根并生长至10叶龄苗 时对其进行200mM/LNaCl盐处理，处理后3d、5d和7d观察不同品种幼苗的受害情况， 记录受害叶数，评定盐害指数，盐害指数分为5级，1级：植株基本无受害症状，叶片绿色、 健康；2级：植株基本正常，下部叶片稍有黄斑或黑斑；3级：植株有些灰暗无生气，下部 有2-3片叶明显发黑或萎蔫；4级：植株有些萎蔫，下部4-5片叶变黑且干枯萎蔫；5级： 植株明显萎蔫，中下部叶均已变黑萎蔫或干枯。每个品种每个时间点记录5个植株的萎 蔫指数，取其算数平均值；用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值&作为最终各品 种的耐盐性鉴定数据，由于盐害指数与耐盐性成负相关，隶属函数值&计算公式为：X1 = l-(X-Xmin) + (Xmax-Xmin);
[0020] 公式中的X为某个品种某个指标的测定值，乂_和X_为所有品种该指标的最小值 和最大值；每个品种的最终隶属函数值为各个品种所有指标的隶属函数值的平均值，平均 隶属函数值越大，其耐盐性越强；
[0021] b、菊花品种群体结构分析：
[0022] 1)采用CTAB微量法提取菊花品种的基因组DNA;
[0023] 2)随机选取8个菊花品种基因组DNA对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛 选，将筛选出的扩增条带清晰、稳定且多态性丰富的引物组合用于菊花品种的全基因组分 子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；
[0024] 3)运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的 类群划分，得到每个供试品