种相应的Q值，即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率， 并绘制出群体结构图；
[0025] c、菊花品种亲缘关系分析：应用SPAGeDi软件，根据三种标记的整合数据分析品 种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K矩阵；
[0026] d、与菊花耐盐性紧密关联的分子标记的确定：应用TASSEL5. 0软件中的混合线 性模型MLM进行耐盐性与分子标记的关联分析，将步骤b群体分析中所得到的各个品种的 Q值和步骤c亲缘关系分析中得到的K矩阵都作为协变量计入模型；以两年隶属函数值的 平均值作为耐盐性鉴定的表型数据，应用TASSEL5. 0软件中的混合线性模型MLM进行耐盐 性与分子标记的关联分析，若P〈〇. 01，则认为该标记位点是与菊花耐盐性紧密关联的分子 标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
[0027] 其中，得到的与菊花耐盐性紧密关联的分子标记优选包括：（l)E19M16-3,P值为 0. 0085,R2为4. 49%，扩增引物对为正向引物M16序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物E19 序列如SEQIDN0. 2所示；（2)p1-3，P值为0. 0046，R2为5. 29 %，扩增引物为p1序列如SEQ IDN0. 3所示；（3)EST-SSR187-2,P值为0. 0043,R2为5. 36 %，扩增引物对为正向引物187F 序列如SEQIDN0. 4所示，反向引物187R序列如SEQIDN0. 5所示。
[0028] 利用本发明所述的方法获得的与菊花耐盐性紧密关联的分子标记，包括：（1) E19M16-3，P值为0. 0085，R2为4. 49%，扩增引物对为正向引物M16序列如SEQIDNO. 1所 示，反向引物E19序列如SEQIDNO. 2所示；（2)pl-3,P值为0. 0046,R2为5. 29%，扩增引 物为pl序列如SEQIDN0. 3 所示；（3)EST-SSR187-2,P值为 0. 0043,R2为 5. 36%，扩增引 物对为正向引物187F序列如SEQIDN0. 4所示，反向引物187R序列如SEQIDN0. 5所示。
[0029] 本发明所述的与菊花耐盐性紧密关联的分子标记的引物，分子标记E19M16-3正 向引物M16序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物E19序列如SEQIDN0. 2所示；分子标记 pl-3引物pi序列如SEQIDN0. 3所示；分子标记EST-SSR187-2正向引物187F序列如SEQ IDN0. 4所示，反向引物187R序列如SEQIDN0. 5所示。
[0030] 本发明所述的菊花耐盐性关联分子标记的获得方法在耐盐性菊花育种中的应用。
[0031] 本发明所述的分子标记在耐盐性菊花育种中的应用。
[0032] 本发明所述的分子标记引物在耐盐性菊花育种中的应用。
[0033] 有益效果：
[0034] 本发明选用来源广泛且无直接亲缘关系的100多个菊花品种自然群体为材料，利 用SRAP、SCoT和EST-SSR三种标记技术对其进行全基因组分子扫描，得到了该群体的群体 结构和亲缘关系，结合对该群体所有品种连续两年的耐盐性鉴定数据，运用关联分析方法 获得了与耐盐性紧密关联的分子标记。其优点是：
[0035] (1)研究周期短，一般以自然群体为材料，无需构建专门的作图群体；所用群体遗 传基础广，可同时对同一基因座的多个等位基因进彳丁分析；定位精度尚，可达到单基因水 平；可以通过多年、多点试验去除环境因子对性状统计的影响。
[0036] (2)SSR标记为共显性标记，多态性好，重复性高，覆盖整个基因组，具有多等位 基因的特性；SRAP标记系统具有简便、产率高、易从序列中得到分离条带等优点，该标记 的正反引物分别针对基因组的内含子和外显子区域设计，对开放阅读框（openreading frames，ORFs)进行扩增，与SSR标记的扩增区域互补，可以作为SSR标记的补充标记；SCoT 标记为显性标记，具有操作简单、引物设计简单、能有效产生与性状连锁的标记、重复性好 等优势。本研究同时运用SRAP、SCoT和EST-SSR三种分子标记技术，得到的染色条带多态 性好、重复性高，有利于获得与菊花耐盐性紧密相关的分子标记。
[0037] (3)菊花的传统杂交育种周期长、费时费力，且无法实现定向改良特定性状，在育 种中存在一定局限性。菊花耐盐性关联分子标记的获得可以实现优良耐盐品种提早选择， 减少工作量，大大提高菊花新基因型的选择效率，从而加快育种进程。
【附图说明】
[0038] 图1通过L(K)和AK判断合适的群体数
[0039] 图2 159个菊花品种群体结构（K= 2)
[0040] 图3 159个菊花品种的亲缘关系检测
[0041 ] 图4盐胁迫受害指数的分级
【具体实施方式】
[0042] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0043](一）试验材料及其耐盐性鉴定表型数据的获得
[0044] 试验材料：不同来源且无直接亲缘关系，类型广泛、代表性强的159个菊花品种 (表1)，所有材料保存于"中国菊花种质资源保存中心"，如果其他同行需要，南京农业大学 "中国菊花种质资源保存中心"可向国内单位提供这些种质。分别于2012年和2013年的春 季采取所有品种的健康、生长势一致的脚芽进行穴盘扦插育苗，待扦插苗生根并生长至10 叶龄幼苗时进行盐胁迫处理。
[0045] 表1供试的159个菊花品种
[0046]
[0047]
[0048] 盐胁迫处理方法：分别于2012年和2013年春季采集159个供试切花菊品种的脚 芽扦插于穴盘中，待其生根并生长至10叶龄幼苗时将其从穴盘拔出，清水洗去根部的基质 后用海绵固定在已打好孔的泡沫板上，泡沫板放于塑料周转箱上，使其根部浸没在周转箱 中的蒸馏水里，先缓苗培养4天，用通气栗给液体24小时通气送氧。然后将对照组周转箱 里换为l/2Hoagland营养液，处理组换为l/2Hoagland营养液并添加NaCl，使NaCl的终浓 度为200mM。每个品种的处理组和对照组各8株。
[0049] 指标的观察与测定：盐处理后3d、5d和7d观察不同品种幼苗的受害情况，记录受 害叶数（黄叶、萎蔫叶、干枯叶），评定盐害指数，盐害指数分为5级，1级：植株基本无受害 症状，叶片绿色、健康；2级：植株基本正常，下部叶片稍有黄斑或黑斑；3级：植株有些灰暗 无生气，下部有2-3片叶明显发黑或萎蔫；4级：植株有些萎蔫，下部4-5片叶变黑且干枯萎 蔫；5级：植株明显萎蔫，中下部叶均已变黑萎蔫或干枯。每个品种每个时间点记录5个植 株的萎蔫指数，取其算数平均值。
[0050] 数据处理与分析：采用隶属函数法求出每个时间点盐害指数的隶属函数值，由于 盐害指数与耐盐性是负相关关系，因此采用公式4=i-(x-x_) + (X_-X_);公式中的X 为某个品种盐害指数的测定值，乂_和X_为所有品种盐害指数的最小值和最大值。用各个 品种三个时间点的盐害指数的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐盐性，平均隶属 函数值越大，其耐盐性越强。
[0051] 利用MicrosoftExcel2007软件对两个年份的耐盐性鉴定数据分别进行基本描 述性统计分析（表2)，可以看出，两年所有品种的耐盐隶属函数值范围均为0. 00-1. 00,平 均值分别为〇. 54和0. 50,变异系数分别为47. 80 %和36. 80%。
[0052] 表2 159个菊花品种耐盐性隶属函数值的统计分析
[0053]
[0054] (二）菊花品种群体结构分析：
[0055] 1)采用CTAB微量法提取159个菊花品种基因组DNA，LambdaDNA琼脂糖凝胶电 泳检测DNA浓度和质量，最后用dd