进一步灭活病毒和细菌；
[0036](7)于4°C 10000r/min条件下离心20min，收集上清液；
[0037](8)于冰水浴条件下向(7)上清液中缓慢加入事先研磨至细碎的硫酸铵粉末至饱和度为85%，期间用磁力搅拌器不断搅拌，待硫酸铵溶解完全后，置于4°C过夜盐析；
[0038](9)于4°C 8000r/min条件下离心lOmin，收集沉淀；
[0039](10)用1mM磷酸盐缓冲液(pH7.0，含0.15M氯化钠)复溶(9)中沉淀蛋白质；
[0040](11)按体积，向(10)复溶液中加入0.5%的活性炭，于35°C下，磁力搅拌30min脱腥，于室温5000r/min条件下离心lOmin，收集上清液；
[0041](12)用截留分子量不同的超滤板于4°C条件下将(11)中的上清液分成#>10kDa，10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa 和 #>3kDa 四段；
[0042](13)将各不同分子量段上清液于4°C透析脱盐48h，期间每12h更换一次透析液，再将各段透析液于50°C条件下旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得不同分子量段的抗氧化肽粉。
[0043]由图2可以看出在各酶最适条件下，酶解上清液对DPPH清除率强弱顺序为:风味蛋白酶 > 菠萝蛋白酶 > 胰蛋白酶 > 木瓜蛋白酶 > 碱性蛋白酶 > 胃蛋白酶 > 酸性蛋白酶 > 中性蛋白酶，所以选择风味蛋白酶和菠萝蛋白酶进行分步酶解。
[0044]由图3可以看出，随着硫酸铵饱和度的增加，上清液中的蛋白质浓度逐渐降低即大部分蛋白质被盐析出来，另一方面考虑到硫酸铵的利用率，所以将85%定为硫酸铵盐析的最终饱和度。
[0045]经检测，#>10kDa段、10kDa>#>5kDa 段、5kDa>#>3kDa 段和 #>3kDa 段抗氧化肽粉的产率分别为20.9%、14.3%、10.1 %和7.4%;当各段浓度为1.0mg/mL时，其对应的DPPH清除率分别为 43.89%、51.87%、71.03%和 92.43%。
【主权项】
1.一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括: (1)将发病异育银鲫去鱼头、鱼鳞、鱼皮及内脏，并将剩余的鱼身部分切段；将得到的鱼段在室温下于紫外灯下照射20-30min，以初步灭活病毒及细菌； (2)将初步灭活病毒及细菌的鱼段按质量体积比1:20?30置于正丁醇中，于4?8°C下不断搅拌对鱼段进行脱脂24?32h，冲洗干净，最后用纯水浸泡； (3)按质量体积比Ig:3?5ml向鱼段中加入水，调节pH至7.0?8.0，并按鱼段质量的I?2%加入风味蛋白酶，加热至40?60°C，在搅拌的条件下酶解l_2h ;随后调节酶解液pH至6.5?7.0，并按鱼段质量的0.5?I %加入菠萝蛋白酶，加热至45?50°C，在搅拌的条件下酶解l_2h ; (4)酶解完毕后于沸水浴中煮15-20min灭活蛋白酶及进一步灭活病毒和细菌，离心，收集上清液； (5)于冰水浴条件下向步骤(4)的上清液中加入研磨细碎的硫酸铵至饱和度为85?88%，搅拌待硫酸铵溶解完全后，置于4?6°C过夜盐析； (6)盐析后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液复溶，得到复溶液；按体积向复溶液中加入0.5?1%的活性炭，于35?40°C下搅拌脱腥，离心，收集上清液； (7)用截留分子量不同的超滤板于4?6°C下将步骤￠)的上清液分成#>10kDa、10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa和#>3kDa四段；将各段上清液于4?6°C透析脱盐，旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得不同分子量段抗氧化肽粉。2.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(I)中的鱼身部分切成2-3cm段。3.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的正丁醇浓度为10%。4.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的脱脂每Sh更换一次液体。5.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(4)中的离心具体为:于4°C 10000r/min条件下离心20min。6.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(6)中的盐析后离心具体为:于4°C 8000r/min条件下离心1min ;脱腥后离心具体为:于室温5000r/min条件下离心lOmin。7.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(6)中的磷酸盐缓冲液pH7.0，含0.15M氯化钠。8.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(7)中的透析脱盐每12h更换一次透析液。9.根据权利要求1所述的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步骤(7)中的旋蒸浓缩温度为50°C。
【专利摘要】本发明涉及一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括：经过去除下脚料部位、分段、紫外初步灭活病毒和细菌、正丁醇脱脂、分步酶解、高温进一步灭活病毒和细菌、上清液硫酸铵盐析、缓冲液复溶、活性炭脱腥、超滤板分段、脱盐、旋蒸浓缩和冷冻干燥的方法制备得到不同分子量段抗氧化肽粉。本发明利用发病异育银鲫制备具有高活性的抗氧化肽粉，不仅可以解决发病异育银鲫蛋白质资源浪费及环境污染问题，而且可以变废为宝减少养殖户的损失，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C07K1/36, C07K1/34, C12P21/06, C07K1/30
【公开号】CN105112483
【申请号】CN201510578691
【发明人】史文军, 万夕和, 王李宝, 沈辉, 凌云, 黎慧, 乔毅, 戚原野, 蒋葛, 范贤平
【申请人】江苏省海洋水产研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月11日