一种金枪鱼眼透明质酸的提取方法
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及一种利用金枪鱼眼为原料制备透明质酸的方法。
(二)
【背景技术】
[0002]透明质酸((hyaluronic acid，HA)，又名玻尿酸，是一种由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺交替连接而成的酸性粘多糖。它大量存在于人体皮肤及关节等部位，研究证实，皮肤中的透明质酸有助于保持水分及皮肤弹性，使皮肤显得水润紧致。不仅如此，透明质酸还和创伤愈合、皮肤细胞的增生和移动等多种皮肤生理活动有关。此外，在关节部位，透明质酸还担负着覆盖和保护关节组织、保持关节活动灵活柔滑、缓冲等机能。目前，透明质酸作为一种可吸收、降解的生物材料，已广泛应用于临床医学和高级化妆品生产，表现出良好的市场潜力和应用前景。
[0003]我国海岸线长，海洋鱼类资源丰富，其中金枪鱼由于资源储量丰富，产量也在过去的几十年中一直迅猛增长。金枪鱼的主要用于制作生鱼片和金枪鱼罐头，在加工生产过程中，鱼头作为副产品被废弃，少量被加工成廉价的饲料，这不但造成资源的浪费，而且污染环境，还在一定程度上增加了产品的成本，这就为或获得大量廉价易得的眼球提供了可能。金枪鱼眼主要由玻璃体构成，透明质酸含量高，易于收集，而且是天然透明质酸。因此，本发明以金枪鱼鱼眼为原料，进行HA的提取利用，提高了金枪鱼原料的利用率和生产企业的经济效益。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供金枪鱼眼透明质酸的提取方法，提高金枪鱼眼透明质酸的提取率，促进其经济效益的提升。
[0005]本发明采用的技术方案是:
[0006]本发明提供一种金枪鱼眼透明质酸的提取方法，所述方法包括如下步骤:
[0007](I)从金枪鱼切片后的废弃部分中剥出金枪鱼眼玻璃体，并进行脱脂处理，然后干燥、粉碎，获得鱼眼干粉；
[0008](2)由于透明质酸极易溶于水，因此直接采用蒸馏水浸提法，将步骤(I)获得的鱼眼干粉浸没于蒸馏水中，25°C?35°C浸提I?4h，将浸提液离心，获得上清液；
[0009](3)将步骤(2)上清液与木瓜蛋白酶混合后注入截留分子量为5000_100000Da(优选50000Da)的酶膜反应器，在温度为40°C _70°C、压力0.05MPa-0.3MPa、溶液pH为5.0-8.0的条件下反应，取截留液；
[0010](4)将步骤(3)截留液用乙醇沉淀后，取沉淀物用蒸馏水溶解，获得醇沉溶解液；再向醇沉溶解液中加络合剂进行络合沉淀，取络合沉淀物经盐解离、离心后获得解离上清液，解离上清液再经乙醇沉淀，最后沉淀物经脱水、干燥得到透明质酸；所述络合剂为氯代十六烷基吡啶(CPC)。
[0011]进一步，步骤(I)脱脂处理是指将金枪鱼眼玻璃体与丙酮以质量比1:1-4(优选1:4)混合进行脱脂(所述脱脂即为放置于磁力搅拌器上搅拌即可)。
[0012]进一步，步骤⑵中鱼眼干粉与蒸馏水质量比为1:10-20，优选1:15。
[0013]进一步，步骤(3)所述木瓜蛋白酶以质量浓度0.5%木瓜蛋白酶水溶液的形式加入，木瓜蛋白酶水溶液体积加入量为上清液体积的0.1-0.5 %，优选0.2 %，木瓜蛋白酶酶活为 10000 ?19000U/mg。
[0014]进一步，步骤(3)所述反应是在温度70°C、压力0.25MPa、ρΗ5.0的条件下反应90mino
[0015]进一步，步骤(4)中所述络合剂以质量浓度1-3%氯代十六烷基吡啶水溶液的形式加入，所述氯代十六烷基吡啶水溶液的体积加入量为醇沉溶解液体积的2-10倍(设定I倍CPC为季铵盐阳离子的摩尔浓度等于透明质酸中羧酸根摩尔浓度时加入的量，最终添加量为2?10倍醇沉后溶解液)。
[0016]进一步，步骤(4)中解离络合沉淀物的盐为0.2-0.8mol/L (优选0.5mol/L)氯化钠水溶液，用量为解离络合沉淀物等体积。
[0017]进一步，步骤(4)中截留液沉淀所用乙醇为无水乙醇、体积浓度95%乙醇水溶液或含体积浓度1%乙酸钾的乙醇溶液。
[0018]本发明所述酶膜反应器为本领域公知装置，优选上海羽令过滤器材有限公司的YL-300型酶膜反应器。
[0019]本发明从金枪鱼眼中提取透明质酸的方法，其优点在于:1)原料来自海洋废料，绿色环保，对环境污染小；2)首次在鱼眼透明质酸提取中应用了酶膜反应器，将酶解的高效性与膜的分离特性进行结合，集反应和分离纯化为一体，缩短了反应时间，而且产品质量好，蛋白含量0.3%?0.7%，产品纯度达80%?90% ；3)所用试剂来源广、价格低。
四、【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0021]本发明实施例所用木瓜蛋白酶酶活为10000?19000U/mg。
[0022]本发明实施例所用酶膜反应器的型号YL-300，厂家:上海羽令过滤器材有限公司。
[0023]实施例1
[0024]从金枪鱼切片后的废弃部分中剥出金枪鱼眼玻璃体，投入质量比1:4的丙酮中，放置于磁力搅拌器上进行脱脂处理。脱脂后，离心，沉淀放入真空干燥箱45°C干燥，高速粉碎机进行粉碎，获得鱼眼干粉。取鱼眼干粉，加入15倍质量的蒸馏水，25°C浸提3h，1000r/min离心15min，取上清液，加入上清液体积0.2% (v/v)的木瓜蛋白酶水溶液(质量浓度0.5% )，搅拌均匀后注入截留分子量为50000Da的酶膜反应器(型号YL-300，厂家:上海羽令过滤器材有限公司)，调节温度70°C，压力0.25MPa，pH5.0，反应90min，截留液采用无水乙醇沉淀5h，沉淀用等体积蒸馏水溶解，获得醇沉溶解液，在搅拌下向醇沉溶解液中加入10倍体积的质量浓度3% CPC水溶液进行络合沉淀，10000r/min离心15min，取沉淀，等体积0.5mol/L氯化钠水溶液磁力搅拌解离2h，10000r/min离心15min，解离上清液加3倍体积量的体积浓度95%乙醇水溶液沉淀，取沉淀用无水乙醇脱水后，于40°C真空干燥箱干燥lh，得72mg透明质酸产品，蛋白含量为0.35%，透明质酸纯度为88.25%。
[0025]实施例2
[0026]从金枪鱼切片后的废弃部分中剥出金枪鱼眼玻璃体，投入质量比1:4的丙酮中，磁力搅拌脱脂。脱脂后，离心，沉淀放入真空干燥箱45°C干燥，高速粉碎机进行粉碎。取金枪鱼眼干粉，加入15倍重量的蒸馏水，25°C浸提4h，10000r/min离心15min，取上清液，加入上清液体积量0.2% (v/v)的木瓜蛋白酶水溶液(质量浓度0.5% )，搅拌均匀后注入截留分子量为1000Da的酶膜反应器，调节温度50°C，压力0.1MPa, pH6.0，反应90min，截留液中加入3倍体积的含1% (v/v)乙酸钾的乙醇溶液沉淀5h，沉淀用等体积蒸馏水溶解，获得醇沉溶解液；在搅拌下加入4倍醇沉溶解液体积量的3wt% CPC水溶液进行络合，25°C反应2h，8000r/min离心15min，取沉淀并加入等体积0.5mol/L氯化钠水溶液解离2h，8000r/min离心15min，上清液加3倍体积的95% (v/v)乙醇沉淀2h，取沉淀用无水乙醇脱水后，于40 °C真空干燥箱干燥Ih，得60mg透明质酸产品，蛋白含量0.46 %，透明质酸纯度85.04 %。
[0027]实施例3
[0028]从金枪鱼切片后的废弃部分中剥出金枪鱼眼玻璃体，投入质量比1:4的丙酮中在磁力搅拌下脱脂处理。脱脂后离心，沉淀放入真空干燥箱45°C干燥，高速粉碎机进行粉碎。取金枪鱼眼粉末，加入15倍重量的蒸馏水，25°C浸提2h，10000r/min离心15min，取上清液，加入上清液体积量0.2% (v/v)的木瓜蛋白酶水溶液(质量浓度0.5% )，搅拌均匀后注入截留分子量为5000Da的酶膜反应器，调节温度60°C，压力0.2MPa，pH7.0，反应90min，截留液采用无水乙醇沉淀5h，所得沉淀用等体积蒸馏水溶解，获得醇沉溶解液，在搅拌下向醇沉溶解液中加入8倍体积量的Iwt % CPC水溶液进行络合沉淀，10000r/min离心15min，取沉淀，加入等体积的0.5mol/L氯化钠水溶液解离2h，10000r/min离心15min，上清液加3倍体积的95%乙醇沉淀，沉淀用无水乙醇脱水后，于40°C真空干燥箱干燥lh，得20mg透明质酸产品，蛋白含量0.69%，透明质酸纯度80.12%。
[0029]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于所述方法包括如下步骤: (1)从金枪鱼切片后的废弃部分中剥出金枪鱼眼玻璃体，并进行脱脂处理，然后干燥、粉碎，获得鱼眼干粉； (2)将步骤(I)获得的鱼眼干粉浸没于蒸馏水中，25°C?35TTC浸提I?4h，将浸提液离心，获得上清液； (3)将步骤(2)上清液与木瓜蛋白酶混合后注入截留分子量为5000-100000Da的酶膜反应器，在温度为40°C -70°C、压力0.05MPa-0.3MPa、溶液pH为5.0_8.0的条件下反应，取截留液； (4)将步骤(3)截留液用乙醇沉淀后，取沉淀物用蒸馏水溶解，获得醇沉溶解液；再向醇沉溶解液中加络合剂进行络合沉淀，取络合沉淀物经盐解离、离心后获得解离上清液，解离上清液再经乙醇沉淀，最后沉淀物经脱水、干燥得到透明质酸；所述络合剂为氯代十六烷基吡啶。2.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(I)脱脂处理是指将金枪鱼眼玻璃体与丙酮以质量比1:1-4混合进行脱脂。3.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(2)中鱼眼干粉与蒸馏水质量比为1:10-20。4.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(3)所述木瓜蛋白酶以质量浓度0.5%木瓜蛋白酶水溶液的形式加入，木瓜蛋白酶水溶液体积加入量为上清液体积的0.1-0.5%。5.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(3)所述反应是在温度70°C、压力0.25MPa、pH5.0的条件下反应90min。6.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(4)中所述络合剂以质量浓度1-3%氯代十六烷基吡啶水溶液的形式加入，所述氯代十六烷基吡啶水溶液的体积加入量为醇沉溶解液体积的2-10倍。7.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(4)中解离络合沉淀物的盐为0.2-0.8mol/L氯化钠水溶液。8.根据权利要求1所述的金枪鱼眼透明质酸的提取方法，其特征在于步骤(4)中截留液沉淀所用乙醇为无水乙醇或含体积浓度I %乙酸钾的乙醇溶液。
【专利摘要】本发明提供了一种从金枪鱼眼中分离提取透明质酸的方法，包括如下步骤：从金枪鱼切片后的废弃部分中剥出金枪鱼眼玻璃体，经丙酮脱脂后干燥粉碎；在鱼眼干粉中加入蒸馏水提取，离心得上清液；再采用酶膜反应器处理；然后经乙醇沉淀；再将沉淀物溶解，经络合剂进行络合沉淀，沉淀物用盐解离，离心，解离液再经乙醇沉淀，最后沉淀物经脱水、干燥得到透明质酸产品；该方法提取透明质酸的优点在于：操作工艺简单，原料廉价易得，起到了废物利用、综合开发的效果，为开发高附加值产品开辟了一条道路。
【IPC分类】C08B37/08
【公开号】CN105131150
【申请号】CN201510510730
【发明人】应国清, 王婧茜, 陈建澍, 易喻, 梅建凤, 张彦璐, 龚海平
【申请人】浙江工业大学, 浙江海博食品有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月19日