一种水溶性o-羟乙基壳聚糖纳米颗粒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒及其制备方法与应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002]壳聚糖[β _(1-4) _2_氨基_2_脱氧-D-匍萄糖]是生物界中存在的阳性氨基多糖，它是由甲壳素在碱性条件下水解脱乙酰基得到的。壳聚糖分子上存在着大量的游离氨基和羟基，因此它不但具有良好的保湿性和增湿性，而且还可以通过对其进行功能化修饰，拓展壳聚糖的应用范围；此外，它还具有无生物毒性、良好的成膜性、可生物降解性和较好的生物相容性等优点，因此近年来壳聚糖在保健食品、食品保鲜、化妆品、生物医药、植物病害的防治等领域显示了其独特的应用价值。
[0003]然而，壳聚糖作为药物载体使用时却受限于其水溶性差的缺点。已有大量报道表明，可通过表面修饰的方式解决上述问题。但上述方式制备的壳聚糖纳米颗粒往往尺寸较大，难以进入细胞。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒及其制备方法与应用，本发明使壳聚糖水溶性提高，具有细胞毒性低，易于进入细胞。
[0005]本发明提供的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤:1)在酸性水溶液中，将壳聚糖氧化降解，调节体系的PH值，然后再加入环氧乙烷，发生羟乙基化反应I，得到O-羟乙基壳聚糖水溶液；
[0006]2)将所述低分子量壳聚糖水溶液与D- α -生育酚琥珀酸酯溶液混合，进行共价连接反应，得到壳聚糖衍生物纳米颗粒的水溶液；
[0007]3)将所述壳聚糖衍生物纳米颗粒的水溶液与环氧乙烷混合，发生羟乙基化反应II，即得到所述水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒。
[0008]上述的方法中，步骤I)中，所述酸性水溶液为乙酸水溶液或盐酸水溶液；
[0009]所述酸性水溶液的体积分数可为I?8 %，具体可为8 % ;
[0010]所述壳聚糖与所述酸性水溶液的质量体积比可为5?20g:1L，具体可为1g:1L。
[0011]上述的方法中，所述氧化降解采用的氧化剂为高硼酸钠或双氧水；
[0012]所述壳聚糖与所述氧化剂的质量比可为150:5?12，具体可为25:3 ;
[0013]所述氧化降解的温度可为40?80°C，具体可为60°C ;
[0014]所述氧化降解的搅拌速率可为200?6000r/min，具体可为1200?1500r/min ；
[0015]所述氧化降解的搅拌反应时间可为2?9h，具体可为5h ;
[0016]所述pH值可为10?12。
[0017]上述的方法中，所述壳聚糖与所述环氧乙烷的质量体积比可为3g:10?30mL，具体可为3g:20mL ；
[0018]加入所述环氧乙烷的温度可为O?10°C，具体可为4?5°C ;
[0019]所述羟乙基化反应I的温度可为50?70°C，具体可为60 °C ;
[0020]加入所述环氧乙烷后由O?10°C升至50?70°C的速率为8?15°C /h ;在具体反应时在4?5 °C加入所述环氧乙烷，然后以8?15°C /h速率升温至60°C反应；
[0021]所述羟乙基化反应I的时间可为2?4d，具体可为3d ;
[0022]所述羟乙基化反应I的搅拌速度可为200?6000r/min，具体可为1200?1500r/
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[0023]上述的方法中，所述D- α -生育酚琥珀酸酯溶液(简称TPS)为D- α -生育酚琥珀酸酯溶于丙酮、乙醇、DMF或DMSO中制成的溶液；
[0024]所述D- α -生育酸琥珀酸酯溶液的浓度可为10?20mg/ml，具体可为10mg/ml ；
[0025]所述O-羟乙基壳聚糖与所述D- α -生育酚琥珀酸酯的质量比可为10:2?6，具体可为10:3 ；
[0026]步骤2)中，所述反应的温度可为30?40°C，具体可为35 °C ;
[0027]所述反应的时间可为3?72h，具体可为3h ;
[0028]所述反应的搅拌速度为200?6000r/min。
[0029]上述的方法中，步骤2)中还包括将所述D- α -生育酚琥珀酸酯溶液用EDC/NHS活化的步骤，具体搅拌3h;
[0030]步骤2)还包括将反应液用丙酮透析12?72h，具体可为24h，丙酮透析的过程中更换所述丙酮至少2次；再用二次水透析2?4d，具体可为2d，所述水透析的过程中更换所述水4?8次，然后收集透析袋内的所述壳聚糖衍生物的水溶液；
[0031]所述壳聚糖衍生物纳米颗粒的粒径可为90?150nm，具体可为80?120nm。
[0032]上述的方法中，所述壳聚糖衍生物纳米颗粒与环氧乙烷的质量体积比可为3g:10?30mL，具体可为3g:20mL ；
[0033]加入所述环氧乙烷的温度可为O?10°C，具体可为4?5°C ;
[0034]所述羟乙基化反应II的温度可为40?60°C，具体可为50 °C ;
[0035]加入所述环氧乙烷后由O?10°C升至50?70°C的速率可为8?15°C /h ;在4?5°C将所述环氧乙烷加入，然后缓慢升温至50°C反应；
[0036]所述羟乙基化反应II的时间可为12?36h，具体可为12h ;
[0037]所述羟乙基化反应II的搅拌速度可为200?6000r/min ;
[0038]步骤3)中所述羟乙基化反应的pH值为8?12。
[0039]本发明还提供了上述的方法制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒。
[0040]所述水溶性O-轻乙基壳聚糖纳米颗粒的粒径可为20?80nm具体可为40?80nm。
[0041]上述水溶性O-轻乙基壳聚糖纳米颗粒应用于制备抗癌药物或抗癌药物载体中；
[0042]所述癌具体为乳腺癌、人骨髓神经母细胞瘤或肝癌。
[0043]本发明具有以下优点:
[0044]1、本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖衍生物纳米颗粒在高速搅拌条件下采用氧化降解和羟乙基化修饰的方法，自组装成纳米颗粒，在该反应条件下制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒不但具有良好的水溶性，且保留了 -OH和_順2活性位点。
[0045]2、本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖衍生物纳米颗粒粒径较小，尺寸可控，控制方法简单易行。
[0046]3、本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖衍生物纳米颗粒具有良好的生物相容性和抗癌选择性；通过对正常肝细胞L02活力的检测发现，壳聚糖纳米颗粒无细胞毒性，而对于癌细胞如MCF-7、H印G2、SH-SY5Y均有一定的毒性。
[0047]4、本发明制得的水溶性O-羟乙基壳聚糖衍生物纳米颗粒可作为一种安全而有效的药物载体，可以增加药物的溶解度，通过缓释、控释的形式增长药物的作用时间，从而提高药物的生物利用度。
【附图说明】
[0048]图1为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的制备反应方程式流程图。
[0049]图2为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒与壳聚糖的红外光谱(IR)图。
[0050]图3为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒与壳聚糖的1H-NMR谱图。
[0051]图4为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的透射电镜图。
[0052]图5为本发明实施例1中壳聚糖衍生物纳米颗粒(CS-g-TPS)与水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒(CS-g-TPS-OH)的粒径分布。
[0053]图6为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的UV图。
[0054]图7为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒对L02细胞毒性的影响。
[0055]图8为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒对MCF-7细胞毒性的影响。
[0056]图9为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒对SH-SY5Y细胞毒性的影响。
[0057]图10为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒对IfepG2细胞毒性的影响。
【具体实施方式】
[0058]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0059]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060]实施例1、水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的制备与应用试验
[0061]一、制备
[0062]按照如图1所示的反应方程式进行制备水溶性O-羟乙基壳聚糖。
[0063](I)水溶性O-羟乙基壳聚糖的制备方法
[0064]取1.5g壳聚糖(简称CS)，溶于150ml、体积分数为8%的乙酸水溶液，搅拌至完全溶解，壳聚糖乙酸水溶液转移至三口烧瓶；加入高硼酸钠0.12g，控温60°C，高速搅拌，反应5h后，加氢氧化钠溶液调整反应体系pH值至10?12，控温4?5°C，将1ml环氧乙烧分多次加入反应体系，以8?15°C /h速率升温至60°C，继续控温60°C，1200?1500r/min搅拌，反应3d，得20?40nm的高水溶性O-羟乙基壳聚糖水溶液。
[0065](2)水溶性壳聚糖衍生物(CS-g-TPS)纳米颗粒的制备方法
[0066]取20ml上述制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖溶液(与TPS的质量比是10