:3)，于透析袋内，搅拌透析12h ;抽干水分；控温35°C，将低分子量壳聚糖水溶液加入到事先用EDC/NHS活化的TPS丙酮(浓度为10mg/ml)溶液中，持续搅拌反应3h，将反应后溶液先用丙酮透析ld，再用二次水透析2d (截留分子量?3500)，得到壳聚糖衍生物的水溶液。
[0067](3)具有高生物相容性的水溶性壳聚糖衍生物(CS-g-TPS)纳米颗粒的制备方法
[0068]控温4?5°C，高速搅拌(搅拌的速率为1200?1500rpm)，将环氧乙烷分多次加入到低分子量壳聚糖衍生物(低分子量壳聚糖衍生物与环氧乙烷的质量体积比为3g:20mL)的碱性水溶液(pH 8?12)中，反应时间为过夜(12h)，得水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒(又称PEG化壳聚糖纳米颗粒)，该衍生物具有较好的生物相容性。
[0069]如图2-4所示分别为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的IR图、1H-NMR谱图和透射电镜图。
[0070]如图5所示为本发明壳聚糖衍生物纳米颗粒(CS-g-TPS)与水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒(CS-g-TPS-OH)的粒径分布图，接枝后CS-g-TPS粒径为80?120nm，具体为116nm，PEG 化后 CS-g-TPS-OH 粒径为 40 ?80nm，具体为 56nm。
[0071]如图6所示为本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的UV图，由图6可知，本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒溶于水的溶液的透光率很好，说明本发明水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的水溶性很好。
[0072]二、应用试验
[0073](4) CS-g-TPS对L02细胞毒性检测——MTT试验
[0074]MTT试验测定了上述制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的细胞毒性，其检测原理是:黄色的四甲基偶氮挫盐(3_(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT)能被活细胞线粒体内的琥?白酸脱氢酶转化成蓝紫色的甲臜颗粒，DMSO能溶解该甲臜颗粒，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度值，吸光度值的大小与活细胞数量呈正相关。而死细胞无此功能，故可用此方法间接反应细胞的活力。
[0075]将密度为1.2 X 15个/ml的L02细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μ I ;贴壁24h后，弃掉旧培养液，每孔加入10ul DMEM基本培养基或含有一定浓度的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的基本培养基；孵育12h后，每孔加入100 μ I 5mg/ml MTT溶液；作用4h后，弃掉细胞培养液，每孔加入150 μ I DMSO溶解甲臜颗粒；于摇床上振荡1min后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，结果如图7所示。
[0076](5) CS-g-TPS对MCF-7细胞毒性检测——MTT试验
[0077]将密度为1.0X 15个/ml的MCF-7细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μ I ;贴壁24h后，弃掉旧培养液，每孔加入10ul DMEM基本培养基或含有一定浓度的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的基本培养基；孵育12h后，每孔加入100 μ I 5mg/ml MTT溶液；作用4h后，弃掉细胞培养液，每孔加入150 μ I DMSO溶解甲臜颗粒；于摇床上振荡1min后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，结果如图8所示。
[0078](6) CS-g-TPS对SH-SY5Y细胞毒性检测——MTT试验
[0079]将密度为1.5 X 15个/ml的SH-SY5Y细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μ I ;贴壁24h后，弃掉旧培养液，每孔加入10ul DMEM基本培养基或含有一定浓度的TPS单体、水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的完全培养基；孵育12h后，每孔加入20 μ 15mg/ml MTT溶液；作用4h后，弃掉细胞培养液，每孔加入150 μ I DMSO溶解甲臜颗粒；于摇床上振荡1min后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，结果如图9所示。
[0080](7) CS-g-TPS对H印G2细胞毒性检测——MTT试验
[0081]将密度为1.0 X 15个/ml的IfepG2细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μ I ;贝占壁24h后，弃掉旧培养液，每孔加入10ul 5% DMEM完全培养基或含有一定浓度的TPS单体、壳聚糖衍生物纳米颗粒的完全培养基；孵育12h后，每孔加入20 μ I 5mg/ml MTT溶液；作用4h后，弃掉细胞培养液，每孔加入150 μ I DMSO溶解甲臜颗粒；于摇床上振荡1min后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值，结果如图10所示。
【主权项】
1.一种水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤:1)在酸性水溶液中，将壳聚糖氧化降解，调节体系的PH值，然后再加入环氧乙烷，发生羟乙基化反应I，得到O-羟乙基壳聚糖水溶液； 2)将所述O-羟乙基壳聚糖水溶液与D-α-生育酚琥珀酸酯溶液混合，进行共价连接反应，得到壳聚糖衍生物纳米颗粒的水溶液； 3)将所述壳聚糖衍生物纳米颗粒的水溶液与所述环氧乙烷混合，发生羟乙基化反应II，即得到所述水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中，所述酸性水溶液为乙酸水溶液或盐酸水溶液； 所述酸性水溶液的体积分数为I?8% ; 所述壳聚糖与所述酸性水溶液的质量体积比为5?20g =ILo3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述氧化降解采用的氧化剂为高硼酸钠或双氧水； 所述壳聚糖与所述氧化剂的质量比为150:5?12 ; 所述氧化降解的温度为40?80°C ; 所述氧化降解的搅拌速率为200?6000r/min ； 所述氧化降解的搅拌反应时间为2?9h ; 所述PH值为10?12。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:所述壳聚糖与所述环氧乙烷的质量体积比为3g:10?30mL ； 加入所述环氧乙烷的温度为O?10°C ; 所述羟乙基化反应I的温度为50?70°C ; 加入所述环氧乙烷后由O?10°C升至50?70°C的速率为8?15°C /h ; 所述羟乙基化反应I的时间为2?4d ; 所述轻乙基化反应I的搅拌速度为200?6000r/min。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于:所述D-α -生育酚琥珀酸酯溶液为D- α -生育酚琥珀酸酯溶于丙酮、乙醇、DMF或DMSO中制成的溶液； 所述D- α -生育酚琥珀酸酯溶液的浓度为10?20mg/ml ; 所述O-羟乙基壳聚糖与所述D- α -生育酚琥珀酸酯的质量比为10:2?6 ; 步骤2)中，所述反应的温度为30?40°C ； 所述反应的时间为3?72h ; 所述反应的搅拌速度为200?6000r/min。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中还包括将所述D- α -生育酚琥珀酸酯溶液用EDC/NHS活化的步骤； 步骤2)还包括将反应液用丙酮透析12?72h，所述丙酮透析的过程中更换所述丙酮至少2次；再用二次水透析2?4d，所述水透析的过程中更换所述水4?8次，然后收集透析袋内的所述壳聚糖衍生物的水溶液； 所述壳聚糖衍生物纳米颗粒的粒径为90?150nm。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于:所述壳聚糖衍生物纳米颗粒与环氧乙烷的质量体积比为3g:10?30mL ; 加入所述环氧乙烷的温度为O?10°C ; 所述羟乙基化反应II的温度为40?60°C ; 加入所述环氧乙烷后由O?10°C升至50?60°C的速率为8?15°C /h ； 所述羟乙基化反应II的时间为12?36h ; 所述轻乙基化反应II的搅拌速度为200?6000r/min ； 步骤3)中所述羟乙基化反应的pH值为8?12。8.权利要求1-7中任一项所述的方法制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒。9.根据权利要求8所述水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒，其特征在于:所述水溶性O-轻乙基壳聚糖纳米颗粒的粒径为20?80nm。10.权利要求8或9所述水溶性O-轻乙基壳聚糖纳米颗粒在制备抗癌药物或抗癌药物载体中的应用； 所述癌具体为乳腺癌、人骨髓神经母细胞瘤或肝癌。
【专利摘要】本发明公开了一种水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒及其制备方法与应用。本发明制备方法，包括如下步骤：1)在酸性水溶液中，将壳聚糖氧化降解，调节体系的pH值，然后再加入环氧乙烷，发生羟乙基化反应Ⅰ，得到O-羟乙基壳聚糖水溶液；2)将所述O-羟乙基壳聚糖水溶液与D-α-生育酚琥珀酸酯溶液混合，进行共价连接反应，得到壳聚糖衍生物纳米颗粒的水溶液；3)将所述壳聚糖衍生物纳米颗粒的水溶液与所述环氧乙烷混合，发生羟乙基化反应Ⅱ，即得。本发明制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒有良好的水溶性；颗粒粒径较小，尺寸可控；具有良好的生物相容性和抗癌选择性，作为药物载体，可增加药物的溶解度，能提高药物的生物利用度。
【IPC分类】A61P35/00, C08B37/08, A61K9/14, C08J3/12, A61K47/36
【公开号】CN105131151
【申请号】CN201510608037
【发明人】李虹, 杜立波, 张晗, 刘扬
【申请人】中国科学院化学研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月22日