专利名称：一种透明质酸的生物发酵提取方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵技术领域(基因、细胞、发酵工程)，更具体涉及一种透明质 酸的生物发酵提取方法。
背景技术：
透明质酸广泛存在于动物的各种组织中，其重要功能是保持细胞水分，提高创口 愈合再生能力，减少疤痕，增强免疫力等作用。可用于非留体消炎药，关节炎治疗，眼科、心 外科手术的辅助药品。在治疗烫伤、烧伤、冻伤、人造皮肤方面有独到作用。目前生产透明 质酸是自鸡、羊等动物组织中提取，原料限制高，生产成本高，生物发酵提取透明质酸不受 原料限制，且安全可靠。透明质酸可以广泛用于食品、保健品、化妆品、药品等领域，另外由透明质酸配制 的生化试剂，在生物学界被广泛推广应用。透明质酸在上世纪三十年代欧美国家已有研究，并在七十年代开始自动物组织中 提取，而国内在九十年代才开始研究并用传统提取法小批量生产。传统法大量采用丙酮等 有机溶剂，环境污染大且存在安全隐患，而生物发酵法，安全可靠无污染。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种透明质酸的生物发酵提取方法，方法易行，操作 简便，生产周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质，安全，高效节能，生产过程中不产生 污染。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施—种透明质酸生物发酵提取方法，其步骤如下1、以链球菌为原菌株，以紫外线和亚硝基胍为诱变剂，对原菌株进行诱变，再通过 对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；2、将菌株接种于琼脂培养基上，培养斜面菌种；3、取斜面菌种，接于IOOOml的三角烧瓶中，三角烧瓶中按水和原料的比例加入水 500ml葡萄糖0. 5%、牛肉膏0. 5%、蛋白胨1 %、磷酸二氢钾0. 2%、硫酸镁0. 配制培养 液，37°C培养13-17h，经检查无杂菌污染，生长良好，备用；4、种子罐培养液(原料同上③)120°C灭菌30min，再冷却37°C，将三角烧瓶菌种按 种子罐培养液5%的比例接入，37°C培养13-17h，经检查长势好，无污染，备用；5、发酵罐培养液(原料同上③)120°C再依次灭菌、冷却37°C，将种子罐菌种按发 酵罐培养液10%的比例接入，维持通气量550L/min，37°C培养41-48h ；6、发酵液升温至80°C恒温灭活IOmin ；7、然后按发酵液重量的0. 3%加入活性炭，吸附lh，过滤脱碳和除去菌体；8、过滤液搅拌下加入的CPB水溶液(常用液体试剂配比)，静置收集沉淀，除 去上清液；
9、沉淀加入发酵液等体积的0. 4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h ；10、解离液通过离子交换脱色；11、脱色液经膜分离浓缩和纯化；12、浓缩液加入三倍体积的95 (产品常规浓度)％乙醇，析出沉淀；13、沉淀经干燥得透明质酸成品。所述的链球菌为兽疫链球菌、马链球菌、类马链球菌(中科院微生物储藏所或市 场上购置)。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、采用本发明生产方法，有效地解决了传统工艺带来的环境污染和安全隐患。2、采用本发明脱离了对原材料生产的严重依赖，不因原材料缺少而带来的生产不稳定。3、采用本发明的膜分离技术，对液态物料进行分离、浓缩和纯化，均在常温下操 作、无相态变化、高效节能，并且生产过程中不产生污染。4、本发明采用离子交换进行脱色，既避免了有害物质在产品中的残留，又能保证 产品的天然洁白度。5、本发明生产周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质，安全，无毒副作用，可广 泛用于化妆品、食品、药品等领域。本发明经多次试驳〔得到如下数据
项目化妆品级食品级医药级
外观白色粉末白色粉末白色粉末
分子量1. 6X1061. 6X1061. 6X106
蛋白质^ 0. 1%^ 0. 1%彡 0. 05%
干燥失重< 10%< 10%< 10%
炽烧残渣< 20%< 20%< 20%
PH (0. 水溶液)6. 0-7. 56. 0-7. 56. 0-7. 5
重金属(以铅计)< 20ppm< 20ppm< 20ppm
砷< 2ppm< 2ppm< 2ppm
细菌总数< 100cfu/g< 100cfu/g< 100cfu/g
细菌内毒素--------< lEU/mg
其他微生物指标符合国家标准符合国家标准符合国家标准
产品收率8克/L7克/L6克/L
具体实施例方式下面通过具体的实施例对本发明方法做进一步的详细说明。实施例1 一种透明质酸的生物发酵提取方法，其步骤是A、以兽疫链球菌为原始菌株，分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍 对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌 株；
B、将菌株接种于斜面琼脂培养基上，40°C恒温培养48h，得到斜面菌种；C、IOOOml三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0. 5%、牛肉膏 0. 5%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0. 2%、硫酸镁0. 配制培养液，120°C灭菌30min，降温至 37°C，将斜面菌种接入三角烧瓶，37°C恒温培养15h ；D、按1 10比例接入种子罐，扩培液体菌种(种子罐培养液原料、处理同C)，种子 罐培养液再按以上条件发酵12_16h，再按1 10的比例接入发酵罐(发酵罐发酵液原料、 处理同C)，发酵罐通气发酵45h，发酵完成，经检查生长良好，无污染得到发酵液；E、发酵液升温至80°C恒温灭活lOmin，然后按发酵液重量的0. 3%加入活性炭，吸 附lh，过滤脱碳和除去菌体；F、过滤液搅拌下加入1 %的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液；G、沉淀加入发酵液等体积的0. 4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h ；H、解离液通过离子交换脱色；脱色液经膜分离浓缩和纯化；I、浓缩液加入三倍体积的95%乙醇，析出沉淀；沉淀经干燥得透明质酸成品，一 般收率为8克/L。实施例2 A、以类马链球菌为原始菌株，分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍 对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌 株；B、将菌株接种于斜面琼脂培养基上，40°C恒温培养36h，得到斜面菌种；C、IOOOml三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0. 5%、牛肉膏 0. 5%、蛋白胨1%、磷酸氢二钾0. 2%、硫酸镁0. 配制培养液，120°C灭菌30min，降温至 37°C，将斜面菌种接入三角烧瓶，37°C恒温培养16h ；D、按1 10比例接入种子罐，扩培液体菌种(种子罐培养液原料、处理同C步骤)， 种子罐培养液再按以上条件发酵16h，再按1 10的比例接入发酵罐(发酵罐发酵液原料、 处理同C步骤)，发酵罐通气发酵45h，发酵完成；E、发酵液升温至80°C恒温灭菌lOmin，然后按发酵液重量的0. 3%加入活性炭，吸 附lh，过滤脱碳和除去菌体；F、过滤液搅拌下加入1 %的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液，沉淀加入发 酵液等体积的0. 4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h ；G、解离液通过离子交换脱色；脱色液经膜分离浓缩和纯化；H、浓缩液加入三倍体积的95%乙醇，析出沉淀；I、沉淀经干燥得透明质酸成品，平均每升发酵液得成品7克。实施例3 A、以马链球菌为原始菌株，分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍对 菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌 株；B、将菌株接种于斜面琼脂培养基上，40°C恒温培养36h，得到斜面菌种；C、IOOOml三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0. 5%、牛肉膏 0. 5%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0. 2%、磷酸氢二钾0. 2%、硫酸镁配制培养液，120°C灭菌30min，降温至37°C，将斜面菌种接入三角烧瓶，37°C恒温培养15h ；D、按1 10比例接入种子罐，扩培液体菌种(种子罐培养液原料、处理同C步骤)， 种子罐培养液再按以上条件发酵15h，再按1 10的比例接入发酵罐(发酵罐发酵液原料、 处理同C步骤)，发酵罐通气发酵45h，发酵完成；E、发酵液升温至80°C恒温灭菌lOmin，然后按发酵液重量的0. 3%加入活性炭，吸 附lh，过滤脱碳和除去菌体；F、过滤液搅拌下加入1 %的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液，沉淀加入发 酵液等体积的0. 4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h ；G、解离液通过离子交换脱色；脱色液经膜分离浓缩和纯化；H、浓缩液加入三倍体积的95%乙醇，析出沉淀；I、沉淀经干燥得透明质酸成品，平均每升发酵液得6克成品。
权利要求
一种透明质酸生物发酵提取方法，其步骤是A、以链球菌为原菌株，以紫外线和亚硝基胍为诱变剂，对原菌株进行诱变，再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；B、将菌株接种于琼脂培养基上，培养斜面菌种；C、取斜面菌种，接于1000ml的三角烧瓶中，三角烧瓶中以按水和原料的比例加入水500ml、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％配制培养液，37℃培养13 17h，经检查无杂菌污染，备用；D、种子罐培养液，原料同步骤(C)，120℃灭菌30min，再冷却37℃，将三角烧瓶菌种按种子罐培养液5％的比例接入，37℃培养13 17h，备用；E、发酵罐培养液，原料同步骤(C)，120℃再依次灭菌、冷却，将种子罐菌种按发酵罐培养液10％的比例接入，维持通气量550L/min，37℃培养41 48h；F、发酵液升温至80℃恒温灭活10min；G、然后按发酵液重量的0.3％加入活性炭，吸附1h，过滤脱碳和除去菌体；H、过滤液搅拌下加入1％的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液；I、沉淀加入发酵液体积的0.4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h；J、解离液通过离子交换脱色；K、脱色液经膜分离浓缩和纯化；L、浓缩液加入三倍体积的95％乙醇，析出沉淀；M、沉淀经干燥得透明质酸成品。
2.如权利要求1所述的一种透明质酸生物发酵的提取方法，其特征在于所述的链球菌 为兽疫链球菌、马链球菌、类马链球菌。
全文摘要
本发明公开了一种透明质酸生物发酵提取方法，其步骤A、以链球菌为原菌株，以紫外线和亚硝基胍为诱变剂；B、诱变株接种于琼脂培养基上，培养斜面菌种；C、取斜面菌种，接入三角烧瓶；D、三角烧瓶菌种按比例接入种子罐扩培；E、发酵罐培养液灭菌、冷却，将种子接入发酵；F、发酵液升温灭活；G、加入活性炭，过滤脱炭除菌体；H、过滤液搅拌下加入CPB水溶液，静置沉淀；I、沉淀加入发酵液体积的氯化钠溶液，搅拌；J、解离液通过离子交换脱色；K、脱色液经膜分离浓缩和纯化；L、浓缩液加入乙醇，析出沉淀；M、沉淀经干燥得透明质酸。方法易行，操作简便，生产周期短、成本低，高效节能，无污染。可广泛用于化妆品、食品和药品等领域。
文档编号C12N15/01GK101914594SQ20101025523
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者叶传发, 张晓东 申请人:武汉嘉发胶原蛋白研究所