一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用_2

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efaciens)。所 述根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具体可为根癌农杆菌GV3101。
[0052] 所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所 述化SOXlO的编码基因转化受体植物得到的第一代转基因植物,也包括其子代。对于转基 因植物,可W在该物种中繁殖该基因,也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的 其它品种,特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0053] 所述化SOXlO在调控植物抗逆性或制备调控植物抗逆性产品中的应用也属于本 发明的保护范围。
[0054] 上述任一所述化SOXlO相关的生物材料在调控植物抗逆性或制备调控植物抗逆 性产品中的应用也属于本发明的保护范围。 阳化5] 所述化SOXlO作为转录因子的应用也属于本发明的保护范围。
[0056] 为解决上述技术问题,本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
[0057] 本发明所提供的一种培育转基因植物的方法,包括如下步骤:向受体植物中导入 编码所述化SOXlO的核酸分子,得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物。
[0058] 上述培育转基因植物的方法中,所述编码所述化SOXlO的核酸分子可为如下1)或 2)或3)所示的DNA分子:
[0059] 1)其编码序列是序列表中序列2的第201-980位脱氧核糖核巧酸所示的DNA分 子; W60]。与1)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性,且编码所述BpSOXlO的DNA分子;
[0061] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核巧酸序列杂交,且编码所述化SOXlO的DNA 分子。 阳06引上文中,所述核酸分子可W是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子 也可W是RNA,如mRNA或hnRNA等。 阳063] 其中,序列表中序列2由1256个核巧酸组成,其编码序列是序列表中序列2的第 201-980位核巧酸,编码序列表中序列1所示的蛋白质。
[0064] 上述任一所述抗逆性具体可为抗盐性。 阳0化]上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字 花科植物;所述十字花科植物可为拟南芥。
[0066] 实验证明,本发明提供一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编码基因能提高 植物的抗盐性:盐处理前,哥伦比亚生态型拟南芥、转空载体植株、纯合转基因L4株系和纯 合转基因L15株系的生长状态良好;200mM化Cl处理后哥伦比亚生态型拟南芥的白化率为 96% ±0.5%,转空载植株的白化率为95% ±0. 1%,L4株系和L15株系的的叶子基本都保 持绿色状态,可见,与哥伦比亚生态型拟南芥相比,L4株系和L15株系的抗盐性显著增加。 结果表明,可W利用本发明的转录因子及其编码基因提高植物的抗逆性。
【附图说明】
[0067]图1为杂交构树幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。 W側图2为3'RACEPCR扩增产物和5'RACEPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结 果。其中,泳道M为TRANS2000DNA分子量标准,泳道1为3'RACEPCR扩增产物,泳道2为 5'RACEPCR扩增产物。 W例 图3为PCR扩增化SOXlO全长CDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中,泳道M为 TRANS2000DNA分子量标准,泳道1为PCR扩增产物。 阳070] 图4为BpSOXlO基因在不同胁迫条件下的相对表达量。
[0071] 图5为化SOXlO基因的亚细胞定位结果。
[0072] 其中,A-D为重组表达载体pCAMBIA1302-BpS0X10转化烟草表皮细胞瞬时表达的 结果,E-H为载体PCAMBIA1302转化烟草表皮细胞瞬时表达的结果;A和E为转化的烟草 表皮细胞在蓝光通道下(观察DAPI,确认细胞核的位置)的形态,B和F为转化的烟草表皮 细胞在巧光通道下(GFP巧光蛋白的观察)的形态,C和G为明视场下的形态,D和H为=个 视场的叠加。
[0073] 图6为化SOXlO基因的转录激活活性分析。
[0074] 其中,A为转基因酵母在平板上的位置;B为转基因酵母在不含化S和Trp的SD培 养基上的生长状况;C为转基因酵母的0-半乳糖巧酶活性检测。
【具体实施方式】
[0075] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。 阳076] 下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0078] TRANS2000DNA分子量标准为北京全式金生物技术有限公司产品。
[0079] 不含His和Trp的SD培养基为北京泛基诺科技有限公司产品,产品编号为 YGM003A-17。
[0080] 载体PMD-18T为Takara公司产品,产品目录号为D103A。
[0081] 含有GAL4结合域的酵母表达载体地ridge购自美国Clontech公司,货号630404。
[0082] 含有化s3和LacZ报道子的酵母AH109株系购自美国Clontech公司,商品目录号 为K1612-1。
[0083] 载体PCAMBIA1302和农杆菌EHA105均为北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司产 品,产品目录号分别为MCV034-N和MCC028。
[0084] 烟草品种Nicotiana t油acum CV Xanth记载在如下文献中:Hoi PX,如y TD,NghiaPT,TutejaN:TransferofgeneencodingforDNAunwinding helicase(pdh45)intotobaccoplants(NicotianatabacumL.cvXanthi)byusing AgrobacteriumandAnalysisoftheTransformedplants.TAPCHISINHHOC 2015, 25(3):83-92.。在下文中烟草品种Nicotianat油acumCVXanth简称为烟草。
[00化]杂交构树度roussonetiakazinokiXB.papyrifera)是中国科学院植物研究所利 用小构树度.kazinoki)与构树度.papyrifera)杂交后经多代培育的品种,可W从北京乔 纳森科技发展有限公司购买。
[0086]重组载体地ridge-JcERF记载在如下文献中:M.Tang,J.Sun,Y.Liu,F.Chen,S. Shen,Isolstion曰ndfunction曰1ch曰r曰cteriz曰tionoftheJcERFgene,曰put曰tive AP2/EREBPdomain-containingtranscriptionfactor,inthewoodyoilplant Jatro地acurcas,PlantMol.Biol. 63 (2007) 419 - 428.
[0087] 实施例1、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因的获得
[0088] 一、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因化SOXlO的3'端序列的克隆
[0089]1、植物材料处理及总RNA的提取
[0090] 对正常生长8周的杂交构树的幼苗进行200mM化Cl溶液处理,处理6小时后提取 杂交构树幼苗的总RNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0091] 结果如图1所示,结果表明,提取的总RNA有两条明显的电泳条带,从上到下依次 为28SRNA和18SRNA,表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。
[0092] 2、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因化SOXlO的3'端序列的克隆
[009引(1)根据已公开的植物序列寻找保守区域,根据保守区域序列设计引物,具体的引 物序列如下:F1 :5' -TGCAGAAAAAGGAAGATCAAGAG-3'。
[0094] (2)W上述步骤1提取的杂交构树幼苗的总RNA为模板,用PrimeScript? 1st StrandcDNASynthesizedKit试剂盒(Takara公司产品)并参照试剂盒说明书的要 求,反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下:01ig〇-dT(10pmol/]il)liiL TotalRNA(《lug) 2JiL,dNTPMixture(lOmmol/Leach) 1.0JiL,SXBuffer4.OuL, RNaseInhibitor(40U/yL)0. 5yL,PrimeScriptRTase(200U/yL)0. 5yI,RNase-free distilledwaterIlyL;65°C5min,42°C45min,70°C15min。将合成的第一链cDNA胆存 于-20°C备用。
[00河 做再W步骤似获得的第一链CDNA为模板,采用引物Fl与引物 OligodT-adaptor5 ' -GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 '进行PCR扩增,得 到3'RACEPCR扩增产物。PCR反应体系为:cDNA模板,Fl引物与Oli
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