godT-adaptor各 1JiL，IOXBuffer2. 5JiL，dNTPMix1:ure(lOmmol/Leach) 2JiL，Taq酶 0. 25JiL和（1地20 12. 25yL。反应程序为：94°C预变性 5min;94°C30s，55°C30s，72°C60s，共 36 个循环；72°C 延伸lOmin。
[0096] (4)反应结束后，对3' RACE PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如 图2所示，其中，泳道1为3' RACE PCR扩增产物。结果表明经3' RACE PCR扩增获得了长 度约为95化P的目的片段。
[0097] 妨回收并纯化3' RACE PCR扩增产物，将其连接到载体PMD-18T上，连接产物转 化大肠杆菌D册a感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行 测序，并对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为968bp，其脱氧核糖核巧酸 序列如序列表中序列3所示。
[0098] 二、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因化SOXlO的5'端序列的克隆
[0099] (1)根据上述步骤一获得的BpSOXlO基因3'端CDNA序列设计引物：R1 : 5' -CTCTACGGTTATCTCTTTGA-3'。
[0100] (2)W步骤一提取的杂交构树幼苗的总RNA为模板，采用Promega公司的5'RACE 试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。 阳101]反应体系及条件如下：1yLRNA，1yL5'-CDSprimerA，1yLSMARTIIA oligo,IJiLDTT(20mM)，IjiLdNTPMix(IOmM),InLMMLVReverseTranscriptase, 2yL5XFirst-StrandBuffer和 2yLsterileH2〇;7(TC2min，冰上 2min，42°CI.化， 72°C7min。
[0102] (3)W步骤似获得的第一链cDNA为模板，采用引物Rl与引物UPM(Promega Shod(2yM) :5' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）配对进行PCR扩增，得到 5'RACEPCR扩 增产物。PCR反应体系为：1JiL50XAdvantage2PolymeraseMix, 34.SuLPCR-Grade Water, 5JiLIOXAdvantage2PCRBuffer,InLdNTPMix(IOmM),IyL50XAdvantage2 PolymeraseMix, 5yLUPM，IyL引物R，2. 5yLcDNA模板。反应条件为：94°C30s; 68°C30s，70°C60s，共 40 个循环；70°C延伸lOmin。 阳10引 （4)反应结束后，对5'RACEPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如 图2所示，其中，泳道2为5'RACEPCR扩增产物。结果表明经5'RACEPCR扩增获得了长 度约为65化P的目的片段。
[0104] 妨回收并纯化5'RACEPCR扩增产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转 化大肠杆菌D册a感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行 测序，对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为668bp，其脱氧核糖核巧酸序 列如序列表中序列4所示。 阳1化]S、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因化SOXlO全长CDNA序列的获得及PCR检测
[0106] 1、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因化SOXlO全长CDNA序列的获得 阳107] 利用上述步骤一和步骤二获得的长度为968bp和668bp片段之间的重叠区，借助 Contig软件拼接得到的全长CDNA序列，其脱氧核糖核巧酸序列如序列表中序列2所示，将 序列2所示的基因命名为化S0X10,自5'端第201-980为0RF，编码由259个氨基酸残基组 成的蛋白质，该蛋白命名为化SOXlO，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。 阳108] 2、PCR检测
[0109] (1)根据化SOXlO基因全长CDNA序列设计如下引物：
[0110]F2 :5' -AGTGTCAGTACTAAACACTTGCTTGCAATC-3';
[0111]R2 :5f-GGTTTTTCAATAGACCCAGTTCATCATA-3'。
[0112] (2)W上述步骤一提取的杂交构树幼苗的总RNA经反转录合成的第一链CDNA为模 板，采用F2和R2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0113] (3)对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。结果表明， 经PCR扩增获得了长度约为1200bp的片段。
[0114] (4)回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌 D册a感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。 阳115] 测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列2所示的核巧酸序列。
[0116] 实施例2、BpSOXlO基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析
[0117] 对杂交构树进行低溫、高盐、干旱和莱莉酸甲醋处理用于分析杂交构树化SOXlO 基因在非生物胁迫下的表达情况。将杂交构树的种子种在培养基中，生长至8周后，对幼苗 分别进行低溫（4°C)、高盐（200mM化Cl溶液）、干旱（PEGww，20% )和莱莉酸甲醋（MeJA， 10%)处理。在不同处理时段，分别收集幼苗，用于提取RNA。具体方法如下所述：
[0118] 低溫处理：将杂交构树幼苗置于4°C培养箱中，分别在光照培养化、比、化、化和 1化小时后取样。
[0119] 高盐处理：将杂交构树幼苗的根系置于200mM化Cl溶液中，分别在光照培养化、 lh、3h、化和12h小时后取样。
[0120] 干旱处理：将杂交构树幼苗的根系置于20%阳Ge。。。溶液中，分别在光照培养化、 lh、3h、化和12h小时后取样。 阳121] 莱莉酸甲醋处理：将杂交构树幼苗的根系置于10%MeJA溶液中，分别在光照培养 0h、lh、3h、化和1化小时后取样。
[0122] 分别提取上述处理杂交构树幼苗的总RNA，然后用PrimeScript? 1stStrand cDNASynthesizedKit试剂盒（Takara公司产品）并参照试剂盒说明书的要求，反转合成 其第一链cDNA。然后采用定量PCR方法分析化SOXlO基因在不同非生物胁迫因子条件下的 表达模式。 阳123]具体步骤如下： 阳124] 1、引物的设计 阳1巧]根据杂交构树化SOXlO的CDNA序列设计其特异性引物QF和QR:并W化actin基 因作为反应的内参，引物序列如下：
[0126]QF:5' -ATGGAAGTGCCATTGAGCTG-3<;
[0127]QR:5' -CTAACATCAAAGACATTCGCTATCAG-3'; 阳128] Bpactin-F:5' -CCGTGCTCAATGGGATACTTC-3';
[0129]化actin-R:5' -CCCTCGTCTGTGACAATGGTAC-3'。 阳130] 2、定量PCR 阳131] 分别W上述处理杂交构树幼苗的cDNA为模板，采用上述步骤1设计的引物进行 Q-PCR扩增。反应体系为：SYBRGreenMix10yLQF0. 4yLQR0. 4yLd地207. 2yL和cDNA模板2yL(将反转录产物稀释10倍后作为模板），总体积为20yL。实时定量PCR反 应采用两步法完成，反应程序为：95°C60s;95°C15s，65°C45s;40个循环。所得数据及Ct 值的分析用Mx300化软件进行。 阳132] 结果如图4所示。结果表明，BpSOXlO基因的转录水平明显受高盐胁迫的诱导，随 着胁迫时间的延长，BpSOXlO基因的相对表达量迅速增加，到处理6小时达到最大值，之后 的表达量逐渐降低；在干旱胁迫和MeJA诱导下化SOXlO基因的表达量稍低，在1化时达到 最大值；在低溫处理下，BpSOXlO基因的表达量变化缓慢。 阳133]实施例3、BpSOXlO转录因子的功能验证 阳134] -、BpSOXlO的亚细胞定位
[0135] 1、将载体PCAMBIA1302的化Ol识别序列和SpeI识别序列间的DNA小片段替换为 核巧酸序列是序列表的序列2自5'末端第201位至第980位所示的DNA分子，得到重组表 达载体，将其命名为pCAMBIA1302-BpS0X10。
[0136] 2、将5yg上述重组表达载体pCAMBIA1302-BpS0X10转入到农杆菌EHA105中，得 到重组农杆菌。
[0137] 3、将重组农杆菌转化烟草表皮细胞（图5中A-D)，同时W转入空载体 PCAMBIA1302的烟草表皮细胞作为对照（图5中E-H)。
[0138] 4、完成步骤3的农杆菌培养24-48小时，然后于DAPI(IOmM)中染色10~20min， 在激光共聚焦扫描显微镜度io-RadMRC1024)下观察并照相。
[0139] 结果见图5。结果表明，转入空载体PCAMBIA1302的转基因细胞中表达的蛋白分布 在整个细胞内，如图5中