F和图5中H;而转入重组表达载体pCAMBIA1302-BpS0X10的转基 因细胞中表达的蛋白则定位于细胞核内，如图5中B和图5中D。结果表明：BpSOXlO定位 于细胞核内。
[0140] 二、BpSOXlO的转录激活活性分析 阳141 ] 1、将含有GAL4结合域的酵母表达载体地ridge的BamHI识别序列和SalI识别序 列间的DNA小片段替换为核巧酸序列是序列表的序列2自5'末端第201位至第980位所 示的DNA分子，保持酵母表达载体地ridge的其他序列不变，得到重组表达载体，将其命名 为地ridge-BpSOXlO。
[0142] 2、将重组载体地ridge-BpSOXlO导入到含有化s3和LacZ报道子的酵母AH109株 系中，得到含有重组载体地ridge-BpSOXlO的转基因酵母；
[0143] 将载体地ridge导入到含有化S3和LacZ报道子的酵母AH109株系中，得到含有 P化idge的转基因酵母，作为阴性对照；
[0144] 将重组载体地ridge-JcERF导入到含有化S3和LacZ报道子的酵母AH109株系中， 得到含有地ridge-JcERF的转基因酵母，作为阳性对照。
[0145] 3、将上述步骤2获得的含有重组载体地ridge-BpSOXlO的转基因酵母、含有 P化idge的转基因酵母和含有地ridge-JcERF的转基因酵母分别在不含化S和T巧的SD培 养基（SD/-His-T巧）上进行培养。
[0146] 结果如图6所示。结果表明，含有地ridge的转基因酵母在不含化S和Trp的SD培 养基上不能生长，而含有重组载体地ridge-BpSOXlO的转基因酵母和含有地ridge-JcERF 的转基因酵母均能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。说明BpSOXlO具有 转录激活活性。 阳147]实施例4、转基因植物的获得[0148] 一、重组质粒的构建 阳149] W载体PCAMBIA1300 (GAMBIA公司产品）为骨架载体，在化ndm和甜al酶切位点 之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子（CaMV35S启动子），甜aI和化nI酶切位 点之间插入序列表的序列2自5'末端第201位至第980位所示的双链DNA分子，得到重组 质粒甲。
[0150] W载体PCAMBIA1300 (GAMBIA公司产品）为骨架载体，在化ndm和甜al酶切位点 之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子（CaMV35S启动子），得到重组质粒乙。 阳151] 二、转基因植株的获得 阳15引 1、将步骤一得到的重组质粒甲导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0153] 2、取步骤1得到的重组农杆菌，通过浸花法转染哥伦比亚生态型拟南芥，然后培 育植株并收获种子，即为Tl代种子。
[0154] 3、将步骤2得到的种子播种于含300mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性植株 化代植株）。 阳155] 4、提取Tl代植物的基因组DNA，进行PCR鉴定。 阳156] PCR鉴定的引物对如下：
[0157]QF:5' -ATGGAAGTGCCATTGAGCTG-3<;
[0158]QR:5' -CTAACATCAAAGACATTCGCTATCAG-3'。
[0159] 如果PCR鉴定为阳性（PCR扩增得到约28化P的扩增产物），该植株即为转基因植 株。每个植株的后代即为一个株系。 阳160] 5、将步骤4中PCR鉴定为阳性的植株自交并收获种子灯2代种子）。 阳161] 6、将步骤5得到的种子培育为植株灯2代植株）并单株收种子灯3代种子）。 阳16引 7、将Ts代种子播种到含300mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性不分离的纯 合单株（即筛选其Ts代种子不发生抗性分离的T2代植株，该植株为纯合的转基因植株）， 将其种子灯3代种子）进行步骤=的各项检测和鉴定。
[0163] =、转空载体植株的获得
[0164] 用重组质粒乙代替重组质粒甲进行步骤二，得到转空载体植株。 阳1化]四、抗盐性
[0166] 待测种子如下：L4株系（100粒Ts代种子）、L15株系（100粒T3代种子）、转空载 体植株（100粒Ts代种子）和哥伦比亚生态型拟南芥（100粒种子）。L4株系和L15株系 为随机取的两个纯合的转基因株系。
[0167] 将待测种子在22°C，1化光照下进行垂直培养，得到5天幼苗，将长势基本一致各 幼苗转移到含200mM化Cl的MS培养基上垂直培养进行盐胁迫处理，5天后统计植株白化率 (盐胁迫处理后有白化叶片的植株株数与盐胁迫处理前植株株数之比）。实验重复=次，每 次重复每个株系8株。 阳16引哥伦比亚生态型拟南芥的白化率为96% ±0.5%，转空载植株的白化率为95% ±0. 1%，L4株系和L15株系的的叶子基本都保持绿色状态。结果表明，与哥伦比亚生态型 拟南芥相比，L4株系和L15株系的抗盐性显著增加。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质： a) 氣基酸序列是序列表中序列1所不的蛋白质； b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质； c) 将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述Al)至A20)中的任一种： Al)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或 2)或3)所示的基因： 1)其编码序列是序列表中序列2的第201-980位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子； 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白 质的DNA分子； 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的 DNA分子。4.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下al)或a2): al)在调控植物抗逆性中的应用； a2)在制备调控植物抗逆性产品中的应用。5.权利要求2或3所述相关生物材料的应用，为如下bl)或b2): bl)在调控植物抗逆性中的应用； b2)在制备调控植物抗逆性产品中的应用。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性。7. 权利要求1所述蛋白质作为转录因子的应用。8. -种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入编码权利要求1所 述蛋白质的核酸分子，得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子 为如下1)或2)或3)所示的DNA分子： 1) 其编码序列是序列表中序列2的第201-980位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白 质的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的 DNA分子。10. 根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性。
【专利摘要】本发明公开了一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的杂交构树盐胁迫相关的转录因子为如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，利用本发明提供的转录因子及其编码基因可以提高植物的抗逆性，对植物应对逆境胁迫的分子育种具有重要价值。
【IPC分类】C07K14/415, A01H5/00, C12N15/82, C12N15/29
【公开号】CN105218653
【申请号】CN201510756134
【发明人】沈世华, 彭献军, 王俞程, 何瑞萍
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月9日