列同源性比对，寻找特异性序列，采用 Primer 3 Input设计引物。设计引物时，GC%设置在45~55%，解链温度（Tm)设置在60~65°C 所得引物序列分别为： (1) 基于五加皮 HMGR 3'_UTR 的引物：F1 :5'_ggcatcatgtactaggatacagtcg_3' ，F2 :5'_ catagtcagactgaatgtaatctgtctac-3' (2) 基于五加皮 rRNA ITS 的引物：F3 :5'_cacgacgtgtgcacgactctagtacg_3' ，F4 :5'_ctgcgtcgctatacgagacgatgccac_3' (3) 基于香加皮 rRNA ITS 的引物：F5 :5'_cggactagtgcgagtatcgtcgcag_3' ，F6 :5'-ggcatgcactcagcagtgaat gcacg-3' 采用DNA合成仪对上述引物进行合成，即得到鉴定引物的白色晶体。
[0014] 上述引物序列经NCBI的nucleotide blast比对后Max score均不超过41，Query cover均不超过75%，并且在公布的五加科植物中未检出Query cover超过50%的序列，说 明引物序列特异性高；最大Max score和Query cover数据如下：
二、引物序列的应用 本发明所得三对引物序列，用于对五加皮和香加皮的检验，检验样品可以是鲜品也可 以是干品或不破坏DNA的炮制品。
[0015] 1、样品DNA提取，具体步骤如下： I、 取1. 0~1. 5g的样品置于研钵中，在研钵中加入液氮没过样品，快速研磨； II、 研磨后的样品装至2. OmL的EP管中，加入800 yL的CTAB抽提液（pH 8. 0 65°C)至 浸没样本，轻轻晃动混匀； III、 将 EP 管 65Γ7Κ浴，30min~60min，每 10min 将 EP 管轻摇混匀溶液，4。。，12000rpm， 离心10min ; IV、 取上清液于新的2.0mL离心管，并加入等体积的苯酚：氯仿溶液（V/V=l :1)，轻摇 2min使其充分混勾，静置10min ;4°C，12000rpm，离心15min ; V、 取上清液于新的2. OmL离心管，并加入等体积的氯仿：异戊醇溶液（V/V=24 :1)，轻 摇混勾，将试管放入离心机中离心，4°C，12000rpm，离心10min ; VI、 取上清液于新的1. 5mL离心管，加入2倍体积的无水乙醇并放置于-20°C冰箱中冷 冻 30min，沉淀 DNA ;取出，4°C，12000rpm，离心 10min ; W、加70%的乙醇清洗EP管中的DNA，置于净化台上风干； VID、将风干后装有DNA的试管加入200 μ L的1 X TE溶液溶解，通过A260值计算DNA的 质量浓度，并将其统一稀释至50.0 ng/ μ 1。
[0016] 2、鉴定 PCR: 将鉴定引物F1、F2以及引物F3、F4和F5、F 6分别用0. 1% DEPC水溶解得6 ymol/L溶 液，在EP管中按下表顺序依次加入PCR反应试剂：
将EP管置于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应： 预变性：95°C 30秒，1个循环； PCR反应：95 °C 5秒，60 °C 30秒，40个循环。
[0017] 3、PCR产物电泳检测 取琼脂糖粉末80 g和加入1.0XTAE 80mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓 慢加热，直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至 50°C -60°C之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒 入已插入梳子的凝胶槽，等待10-20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。
[0018] 取PCR产物5 μ L和1 μ L Lording buffer混合均匀后加入凝胶块样品孔，置于 电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察DNA分离情况。若样品五 加皮HMGR 3'-UTR (F1和F2)和五加皮rRNA ITS (F3和F4)均为阳性（电泳有条带)，则为 五加皮。若仅香加皮rRNA ITS (F5和F6)为阳则为香加皮(如附图2)。若三对引物扩增均 为阴性，则为除五加皮和香加皮外其他材料。
[0019] 本发明的有益效果：一、本发明的三对引物基于高度特异的3'-UTR和rRNA ITS序 列，经同源性分析，超过50%同源性的序列未检索到，引物序列特异性高，能够精确的鉴定 五加皮和香加皮样品。二、本发明中的三对引物在五加皮和香加皮全基因组序列未知的情 况下采用RACE技术扩增获得下游序列，并通过高通量测序获得，属于新发现的序列片段， 并具有中药鉴定的功能。三、本发明的引物的应用时，样品提取DNA而不是RNA，这样对样品 要求较低，可以是鲜品、干品或者简单炮制后(对DNA破坏低的炮制方法）的样品。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明引物序列的获得方法及引物序列的应用的流程图。
[0021] 图2是本发明PCR鉴定的电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例一：引物序列获得的方法 1、同源序列的获得和同源引物设计 通过NCBI进行检索，分别获得刺五加（注册号JQ905593)、拟南芥(注册号： AY488113)、三七（注册号：KP702301)、人参（注册号：⑶565098)、西洋参（注册号： FJ755158HMGR)的HMGR序列并在NCBI上应用blast进行同源序列分析，再采用Clustal X 软件进行多序列同源性比对，根据HMGR ORF区的保守区设计HMGR同源PCR引物（HMGR引 物序列：上游 Fa :5'_agtaaattcagggggagtcata_3' 和下游 Fb :5'_caccattttcaactttaactgg tg-3'），该引物在后续五加皮DNA样品PCR中验证能够扩增得到DNA片段，说明PCR引物在 五加皮同样具有保守性。18S rRNA在不同物种间具有高度保守性，通过NCBI进行检索，分 别获得刺五加（注册号：AB080245)、拟南芥（注册号：X16077)、三七(注册号：AB027525)、人 参(注册号：D83275)、西洋参(注册号：D85172)18S rRNA基因序列，并在NCBI上应用blast 进行同源序列分析，再采用Clustal X软件进行多序列同源性比对，根据18S rRNA的保守 区设计同源 PCR 引物（18S rRNA 引物：上游 Fc :5' -ggtcgacgcgggctctggct-3' 和下游 Fd : 5'-gcggttcgccgccggcgacgtcg-3'），该引物在后续五加皮和香加皮DNA样品PCR中验证能够 扩增得到DNA片段，说明PCR引物在五加皮同样具有保守性。
[0023] 2、样品总RNA提取 分别取五加皮和香加皮鲜根组织100 mg置于研钵中，加入1.0 mL Trizol充分研磨， 研磨过程中不断加入液氮。将匀浆移入1.5 mL EP管，冰浴5分钟。每管加入0.2 mL氯仿， 震荡15 s，冰浴2~3 min。12000 r/min，4°C离心5 min，吸取上清液移入1.5 mL新EP管 中，加入0. 5 mL异丙醇，轻轻地上下颠倒混勾，冰浴10 mirul^OOO r/min，4°C离心5 min， 弃去上清液，加1 mL 75% DEPC水配制的乙醇，震荡拍匀使RNA沉淀重新悬浮。12000 r/ min，4°C离心5 min，缓慢倾倒EP管弃去上清液，超净工作台下EP管倒置于无菌吸水纸上， 自然干燥30 min，加入0. 1% DEPC水20~50 μ L混匀、溶解RNA，-80°C冰箱中保存备用。
[0024] 3、总 RNA 检测 取琼脂糖粉末80 g和1.0XTAE 80 mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓慢加热， 直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至50°C ~60°C 之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒入已插入梳 子的凝胶槽，等待10~20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。
[0025] 取RNA样品5 μ L和1 μ L Lording buffer混合均勾后加入凝胶块样品孔，置于 电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察RNA分离情况。另取5 μ L RNA样品溶解于690 yL蒸馏水中，混匀，紫外分光光度计中测定0D值。取RNA样品0D26。/ 0D2SM>1. 8进行后续实验操作。
[0026] 4、3' -RACE 扩增获取 0RF 下游 UTR 和 ITS (1)反转录合成cDNA第一链 在100μLPCR管中建立3'-RACEcDNA第一链合成体系（如下表)，其中3'-CDS引物为 试剂盒所带引物：
将以上反应体系混匀，70°C水浴120s后，冰浴120s，迅速离心后分别加入下表的试剂。 混合各组分并离心，恒温金属浴中42°C反应90 min，每管中加入0. lmL TE缓冲液稀释反应 体系，72 °C反应7min，所得样品-70 °C保存。
(2)