大熊猫抗病毒潜力检测的i类mhc基因的特异性引物及分型方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于扩增大熊猫I类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC)基因二号及三号外显子的特异性引物，尤其涉及大熊 猫抗病毒潜力检测的I类MHC基因的特异性引物及分型方法。
【背景技术】
[0002] 大熊猫（Ailuropoda melanoleuca)是国家一级保护动物，在2008年已被《世界自 然保护联盟》（IUCN)列入濒危物种红色名录，同时大熊猫也是世界自然基金会的形象大使 和世界生物多样性保护的旗舰物种。由于以竹子为主食的大熊猫虽仍保留着食肉动物的牙 齿和消化道特征，其漫长的演化过程和成功存活的原因也备受科学界关注。被誉为"国宝" 的大熊猫在距今60万年前曾广泛分布于我国东南黄河、长江和珠江流域，然而现代农林业 的发展破坏了大熊猫的栖息地，使它们的分布缩小到四川、陕西和甘肃三省毗邻的高山峡 谷中。如今大熊猫种群彼此孤立在秦岭、岷山、邛崃上、大相岭、小相岭和凉山六个山系。
[0003] -系列保护遗传学研究采用分子技术利用中性标记（如线粒体DNA控制区、指纹 图谱和微卫星标记等）来了解不同山系间大熊猫种群的遗传多样性和种群分化模式，发现 栖息地的破坏使得大熊猫产生近交，对于像大熊猫这样的小种群来说近交带来的近交衰退 和遗传负荷会使物种群体适应度下降最终导致灭绝。这些研究虽然为设计大熊猫保护育种 方案提供了帮助，但并未反映出大熊猫在种群演化过程中的适应性能力，而这一重要信息 是建立全面保育方案不可或缺的部分。另外，如今高疾病感染率和高死亡率严重威胁着大 熊猫的生存。因为主要组织相容性复合体（MHC)具有结合及呈递抗原从而激发相应免疫反 应的功能，所以其在面对多变的病原时展现的适应性进化是评估一个物种适应性能力的标 记。因此深入研究大熊猫的MHC基因家族，能帮助我们评估大熊猫的适应性能力和进一步 了解其高染病率的成因。
[0004] I类MHC基因编码丰富的细胞表面蛋白，这些蛋白位于机体内所有有核细胞表面。 当细胞遭病毒侵入，病毒碎片将透过I类MHC提示在该细胞外侧供杀手T细胞等辨识，从而 开启被感染细胞和其中病毒的清除过程。由此可见，机体对病毒的易感性和自身免疫能力 等多种生物学特征都将受I类MHC基因的基因型、表达多样性及表达丰度影响。经典I类 MHC结合病毒抗原肽部位由基因二号和三号外显子编码，研究这两个位点的遗传变异和山 系分化有助于我们探究与大熊猫疾病有关的I类MHC等位基因和了解该物种的抗病毒感染 能力强弱。然而，由于MHC基因是多基因家族，基因复制和协同进化使同一座位上的不同等 位基因差异较大，在用通用引物进行多位点扩增时可能无法扩增所有等位基因导致无效等 位基因产生，而不同座位之间的等位基因又高度相似，通用引物会交叉扩增不同座位等位 基因。另外，研究关注有功能的MHC基因，而大量不表达的MHC假基因会成为干扰数据。因 此，在正确分离和鉴定大熊猫所有表达的I类MHC基因的基础上，设计座位特异引物并正确 进行大熊猫I类MHC基因分型和基因多态性分析是研究与病毒引起的疾病有关的特定等位 基因和评估大熊猫抗病能力的必要前提，对大熊猫保育计划设计有重要借鉴意义，比如野 外放归时选择适应能力强的个体和选择优良个体进行人工配种。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供大熊猫I类MHC区域4个经典座位（Aime-C、Aime-F、Aime-I及 Aime-L)二号和三号外显子扩增的特异性引物及分型方法，它能满足现有技术的上述需求。
[0006] 用于扩增大熊猫I类MHC区域Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二号及三号 外显子的特异性引物组包括十一对引物对，所述引物对的核苷酸序列如下所示：
[0007] 引物对一：上游引物 yyE2Bl: TCAGCCCCTCCGCGCCCGCAG (如 SEQ ID NO: 1 所示）；
[0008] 下游引物 yyE2B2:GACCCGGGCCGCGTCGCTCAC (如 SEQ ID N0:2 所示）；
[0009] 引物对二：上游引物1611H2F:ATGACGTATTTCTACACCGGC(如SEQIDN0:3所示） ；
[0010] 下游引物 1R:TCCATTTTCCCTTCCTGGTGGG (如 SEQ ID N0:4 所示）；
[0011] 引物对三：上游引物 152E2A3:GCCCTGCTCTCCCCCACTCAG (如 SEQ ID N0:5 所示）；
[0012] 下游引物 152E2A4:CGGGGGTTCCTGAGAGTTGGGGC (如 SEQ ID N0:6 所示）；
[0013] 引物对四：上游引物 152E3A1:AGTCCGAGCGTTGCCCCAACTCTC (如 SEQ ID N0:7 所 示）；
[0014] 下游引物 152E3A2:AGTAATGGCCCTGAGTAAGGTTTC (如 SEQ ID N0:8 所示）；
[0015] 引物对五：上游引物 128E22F:CCTGCTCTCCCCAACGCG (如 SEQ ID N0:9 所示）；
[0016] 下游引物 128E22R:GTCACAGCCGTGCATCCA(如 SEQ ID NO: 10 所示）；
[0017] 引物对六：上游引物 128E3 IF: CCGAGTGGACTTGCAGACCGCC (如 SEQ ID NO: 11 所 示）；
[0018] 下游引物 128E32R:GTCCGGGGTTTCTGAAGAAGAACG (如 SEQ ID N0:12 所示）；
[0019] 引物对七：上游引物 1300E22F: GGGAGAAGGGTCGGGCGGGAC (如 SEQ ID NO: 13 所 示）；
[0020] 下游引物 1300E21R:AGGTCACAGCCGTGCATCTC(如 SEQ ID N0:14 所示）；
[0021] 引物对八：上游引物 1300E32F:GCTCTCACACCATCCAGGA(如 SEQ ID NO: 15 所示）；
[0022] 下游引物 l3〇OE3lR:GTCGGGGGTTTCTGAAGAAGAATC(如 SEQ ID NO: I6 所示）；
[0023] 引物对九：上游引物 yySE23F:CGCCCGCAGGCTCGCACTCC(如 SEQ ID NO: 17 所示）；
[0024] 下游引物 yySE22R:GCAGGATGTTCAGGCTCT (如 SEQ ID NO: I8 所示）；
[0025] 引物对十：上游引物 152E3B1:TCGCCTCCTGTCGGGCGGGGCCAG (如 SEQ ID N0:19 所 示）；
[0026] 下游引物 152E3B2:AGCCAGCCCCAGCGGAGGGG (如 SEQ ID NO:2〇 所示）；
[0027] 引物对十一：上游引物 1300E32F: GCTCTCACACCATCCAGGA (如 SEQ ID NO: 15 所 示）；
[0028] 下游引物 152E3B2:AGCCAGCCCCAGCGGAGGGG (如 SEQ ID NO:2〇 所示）；
[0029] 其中，引物对一、引物对三、引物对五及引物对七分别为Aime-C、Aime-F、Aime-I 及Aime-L二号外显子巢式PCR外侧引物；引物对九为Aime-C二号外显子巢式PCR内侧引 物，而引物对一为Aime-F、Aime-I及Aime-L二号外显子共同的巢式PCR内侧引物；引物 对二、引物对四、引物对六及引物对八分别为Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L三号外显 子巢式PCR外侧引物；引物对^ 为Aime-L二号外显子巢式PCR内侧引物，而引物对十为 Aime-F、Aime-I及Aime-C三号外显子共同的巢式PCR内侧引物。
[0030] 一种大熊猫I类MHC区域Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二号及三号外 显子的分型方法是采用所述的引物，以从大熊猫粪便中用酚氯仿法提取的DNA为模板，每 对引物分别进行巢式PCR扩增，第一轮巢式PCR用10yL体系，第二轮巢式PCR用30yL体 系，在特定PCR扩增条件下进行目标片断扩增，然后将扩增产物利用SSCP对每个位点分别 进行基因分型。
[0031] 扩增大熊猫Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二号及三号外显子的第一轮 PCR 10yL PCR 体系是：5yL 2x GC Buffer，0.8yL 2.5mM 的dNTP，0.3yL 10mM 的第一轮 巢式PCR上游引物，0. 3yL lOmM的第一轮巢式PCR下游引物，0. lyL 5U/yL的Ex-Taq酶， lμL基因组DNA，2·5μL灭菌超纯水；第二轮PCR30μL体系是：3μL10xEχ-TaqBuffer， 2.4yL 2.5mM的dNTP，0.9yL 10mM的第二轮巢式PCR上游引物，0.9yL 10mM的第二轮巢 式PCR下游引物，0. 3yL 5U/yL的Ex-Taq酶，1 yL第一轮PCR产物，21. 5yL灭菌超纯水。
[0032] 扩增大熊猫Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二号外显子的第一轮PCR扩增 条件是：95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，退火30秒，此处扩增Aime-C、A