一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农产品、食品质量安全分子检测应用技术领域，具体涉及一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法。该芯片为4层、圆盘离心式设计，每张芯片分为20个样品区，每个样品区包含12个检测小室。配套光驱型离心机、温控设备及核酸扩增试剂耗材，可满足农产品、食品中转基因成分、致病菌、动植物物种等分子检测需要，具有快速、便捷、通量高等特点。
【背景技术】
[0002]分子检测技术是一种以农产品、食品中核酸差异为分析目标的的新型检测技术，克服了传统检测技术中传统的检测手段具有灵敏度低、特异性差、成本高、费时费工等明显缺点。目前主流的分子检测技术有PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR、环状等温扩增、基因芯片技术等，具有快速、精准、灵敏度高、特异性强、高通量等优点，已经成熟应用于微生物鉴定、转基因成分、物种鉴定等检测领域。
[0003]聚合酶链式反应技术诞生于1985年，利用变性与复性原理，在体外使用DNA聚合酶，在引物的引导和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的参与下进行百万倍扩增；反应步骤包括变性、复性和延伸，在1-2小时内选择性地放大特定的DNA片段，通过电泳进行产物分析。具有快速、稳定、普及率高的特点。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied B1systems公司推出，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析；与常规PCR的定性分析相比，real timePCR具有定量分析、通量高、自动化程度高等特点。环状等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal ampl1-ficat1n),是 2000 年日本学者 Notomi 在 Nucleic Acids Res 杂志上公开了一种新的基因诊断技术。其原理是针对靶标DNA序列6个区域设计4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶和DNA在65 °C左右的动态平衡状态，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。基因芯片(GeneChip、DNA Microarray)是指将大量核酸片段(寡核苷酸/PNA、cDNA、基因组DNA)以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜等载体上组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶标DNA序列的数量及组成。基因芯片技术的基本流程包括DNA方针的构建、样品制备、杂交、杂交图谱扫描，具有检测通量高、高达自动化、效率高、特异性强的技术优点。
[0004]分子检测技术推动农产品、食品质量安全，但还存在方法体系不够健全、解决问题不够全面、配套产品不够完善的问题。微流控芯片可以提高完整的平台。
[0005]微流控芯片(microfluidic chip)最初在美国被称为“芯片实验室” (lab-on-a-chip)，在欧洲被称为“微整合分析芯片” (micrototal analyticalsystems)，是把生物和化学领域所涉及的基本操作单元集成在一块几平方厘米的芯片上。操作级别单元尺寸在微米量级。已经在新药筛选、细胞捕获、分选、代谢反应观察、食品、农产品安全如农兽残、重金属、添加剂检测中应用。该平台具有以下优点:
[0006]I样品需要量小、低能耗
[0007]2分离效率高、分析速度快
[0008]3设备体积小、集成化
[0009]4高通量、自动化程度高
[0010]本专利立足我国农产品、食品中分子检测产品发展需要，利用微流控芯片便携、高效、高通量的优势和核酸扩增技术的快速特点，发明了一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法，具有实际应用价值。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于公开了一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法，其特征在于该芯片外观呈光盘状，外径120mm，内径15mm ;该芯片共有4层组成，分别为底板层、引物层、反应层、进样层；该芯片分为20个反应区，每个反应区包括序号标示点、I个进样孔和12个反应小室，因此可满足20个样品、每个样品最多12个参数的检测。
[0012]为实现上述目的，本发明参与以下制作步骤:
[0013](I)使用计算机软件绘制出微流控检测芯片每一层的结构和通道图形，用于后期的喷绘、打印和刻蚀。
[0014](2)在底板层上喷绘出20个序号标示点和20个反应区。
[0015](3)在引物层上应用打印技术在20个反应区、每个反应区12个反应小室共240个区域喷墨打印寡聚核苷酸弓I物序列，冷冻干燥保存。
[0016](4)在反应层上刻蚀出20个样品室、通道和240个反应室，每个反应室体积约
I μ Lo
[0017](5)在进样层上打印出进样标线，刻蚀出20个进样孔。
[0018](6)对应叠加、贴合4层结构，形成三维立体的微流控检测芯片。
[0019]本发明设计和制作的微流控检测芯片，可采用下述方法使用:
[0020](I)提取待测样品DNA模板，稀释至20_100ng/ μ L，取I μ L模板、加入核酸扩增反应体系(含有荧光显色剂)共16 μ L，混匀，使用排枪5通量加入样品室。
[0021](2)将加完样品的微流控检测芯片放入光驱式离心机，1200rpm离心lmin，置于温控设备中进行扩增。
[0022](3)扩增结束后，日光灯或紫外灯或成像设备中观察检测结果。
[0023]本发明中所述的核酸扩增技术，包括PCR技术、实时荧光PCR技术、环状等温扩增技术等，其目的是在短时间内获得大量的扩增产物，以满足结果观察的需要。
[0024]本发明所述的寡核苷酸引物序列，是针对目的基因，结合核酸扩增方法，设计、合成的引物序列，其目的是锚定特异序列区域进行扩增。本发明将引物序列采用喷墨打印的方式将引物打印在芯片第二层上，并通过真空干燥的方法进行固定。
[0025]本发明所述的待测样品DNA模板，指的是使用DNA提取试剂盒从农产品、食品中提取的基因组DNA。
[0026]为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
[0027]I 原理
[0028]本发明的检测微流控芯片采用4层、圆盘式设计，利用离心力的原理，将反应试剂通过管道输送到反应小室中进行反应；整个芯片的制作应用了打印、喷墨、刻蚀等技术，在有机材料中形成三维立体的通道和小室。
[0029]2外观设计
[0030]其特征在于该芯片外观呈圆盘状,大小同光盘大小一致,外径120mm,内径15mm ；该芯片共有4层组成，分别为底板层、引物层、反应层、进样层；每个芯片分为20个反应区，每个反应区包括序号标示点、I个进样孔和12个反应小室，因此可满足20个样品、每个样品最多12个参数的检测。
[0031]3制作步骤
[0032](I)使用计算机软件绘制出微流控检测芯片每一层的结构和通道图形，用于后期的喷绘、打印和刻蚀。
[0033](2)在底板层上喷绘出20个序号标示点和20个反应区(图1)。
[0034](3)在引物层上应用打印技术在20个反应区、每个反应区12个反应小室共240个区域喷墨打印寡聚核苷酸引物序列，冷冻干燥保存(图2)。
[0035](4)在反应层上刻蚀出20个样品室、通道和240个反应室，每个反应室体积约I μ L (图 3)。
[0036](5)在进样层上打印出进样标线，刻蚀出20个进样孔(图4)。
[0037](6)对应叠加、贴合4层结构，形成三维立体的微流控检测芯片(图5)。
[0038]4应用方法
[0039](I)使用DNA提取试剂盒提取待测样品DNA模板，稀释至20_100ng/ μ L ;取I μ L模板、加入核酸扩增反应体系(含有荧光显色剂)共16 μ L，混匀，使用排枪5通量分4次加入20个样品室。
[0040](2)将加完样品的微