该菌在文献"王卫芳，章柱，余 辛.从进境美国樓桃中首次截获美澳型核果褐腐病菌，植物检疫，2012, 26巧）：88-91"中公 开；菌株21保藏于广东出入境检验检疫局检验检疫技术中屯、，该菌在文献"王卫芳，胡佳， 赵立荣等.进境美国苹果星裂壳抱梨果腐病菌的首次截获一一病原真菌的鉴定及风险分 析，植物病理学报，2011，41 (3) :232-239 "中公开。
[00巧] 表1
[0056]
[0057]
[005引 2、实时巧光PCR扩增
[0059] 采用化0F/NeoR共2条引物及MkP、阳R-P、ALB-P、KIE-P共4条探针，分别W 上述步骤1中所提取的21株菌的基因组DNA为模板进行巧光定量PCR。
[0060] 实时巧光PCR反应体系W20μL计为：
[0061] 模板DNA 50ng
[0062] 引物 每条引物的终浓度均为〇.5ymol/L
[0063] 探针 每条探针的终浓度均为0. 25μmol/L
[0064] 2XThunderbirdProbeqPCRMix10μL
[0065] (1地2〇 补足至 20μL ;
[0066] 其中，2XThunderbirdProbeqPCRMix内含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲 液、R0X;2X化underbirdProbeqPCRMix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，货号为 QPS-lOlo
[0067] 实时巧光PCR反应条件为：95°C10分钟；94°C15秒，60°C60秒，共40个循环，每 个循环结束后在FAM、CY5、肥D、肥X通道下检测巧光信号。
[006引 3、实时巧光PCR结果判断
[0069] 根据FAM、CY5、肥D、肥X通道下的巧光信号Ct值进行结果判断。若FAM通道 下Ct值小于35,则判为N.malicodicis阳性，若Ct值大于35或无扩增信号则判为 N.malico;rticis阴性；若CY5通道下Ct值小于35,则判为N.perennans阳性，若Ct值大于 35或无扩增信号则判为N.perennans阴性；若肥D通道下Ct值小于35,则判为N.a化a阳 性，若ct值大于35或无扩增信号则判为N.a化a阴性；若肥X通道下Ct值小于35,则判为N. kienholzii阳性，若Ct值大于35或无扩增信号则判为N. kienholzii阴性；
[0070] 结果如图1-4所示，其中图1是FAM通道下的实时巧光PCR扩增结果图，图2是 CY5通道下的实时巧光PCR扩增结果图，图3是肥D通道下的实时巧光PCR扩增结果图，图 4是肥X通道下的实时巧光PCR扩增结果图。
[0071]图1中有2株菌的ct值小于35,表现为阳性扩增，其余19株菌无扩增，表现为阴 性，说明在运21株菌种检出2株N.malico;rticis，其余菌株均不是N.malico;rticis;图2 中有6株菌的Ct值小于35,表现为阳性扩增，其余15株菌无扩增，表现为阴性，说明在运 21株菌种检出6株N.perennans，其余菌株均不是N.perennans;图3中有6株菌的Ct值 小于35,表现为阳性扩增，其余15株菌无扩增，表现为阴性，说明在运21株菌种检出6株 N.a化曰，其余菌株均不是N.a化a;图4中有1株菌的Ct值小于35,表现为阳性扩增，其余 20株菌无扩增，表现为阴性，说明在运21株菌种检出1株N.kienholzii,其余菌株均不是 N.kienholzii。
[0072] W上结果说明，本发明的引物探针组和方法特异性好。
[0073] 实施例3检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR灵敏度实验
[0074] 1、DNA的提取
[00巧]参照试剂盒说明操作（植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02,天根生 物科技有限公司）分别提取N.malicodicis(CBS102872)、N.perennans(CBS102873)、 N.a化a(CBS109875)和N.Kienholzii(CBS355. 72)的基因组DM。并将得到的基因组DNA 进行 10 倍稀释，分别制备得到浓度为 100ng/yL、10ng/yL、lng/yL、0.lng/yL、0.Olng/ μL和 0.OOlng/μL的N.malicorticis的基因组DNA、浓度为lOOng/μL、lOng/μL、 Ing/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL的N.perennans的基因组DM、浓度为 lOOng/μL、lOng/μL、Ing/μL、0.Ing/μL、0.Olng/μL和 0.OOlng/μL的N.a化a的基因 组DM、浓度为lOOng/yLlOng/yLlng/yLO.Ing/yLO.Olng/yL和 0.OOlng/yL的 N.Kienholzii的基因组DM。
[007引 2、实时巧光PCR扩增
[0077]采用实施例2的步骤二中的检测引物苹果牛眼果腐病的4种病原菌的方法，分别W步骤一中得到的梯度稀释DNA为模板（1μL)，每种菌6个浓度梯度，共4种菌，一共24个 反应，进行灵敏度实验。
[007引 3、实时巧光PCR结果判断
[0079] 结果如图5-8所示，其中图5是FAM通道下的实时巧光PCR扩增结果图、图6是 CY5通道下的实时巧光PCR扩增结果图、图7是肥D通道下的实时巧光PCR扩增结果图、图 8是肥X通道下的实时巧光PCR扩增结果图。
[0080]FAM、肥D、肥X通道下均能检测到0.0 Olng/ μL的DNA(Ct值小于35)，CY5通道下 能检测到0.0 lng/ μL的DNA(Ct值小于35)。说明本发明实时巧光PCR引物探针组合具有 较高的灵敏度。
[0081] 实施例4检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR的实际应用 [00的]1、DNA的提取
[0083]参照试剂盒说明操作（植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02,天根生物科 技有限公司）分别提取从样品中分离到的29株菌的基因组DM。
[0084] 2、实时巧光PCR扩增
[0085] 采用实施例2中步骤二的检测引物苹果牛眼果腐病的4种病原菌的方法，分别W 步骤1中提取的29株菌的基因组DNA为模板进行实时巧光PCR扩增。
[0086] 3、实时巧光PCR结果判断
[0087] 根据实施例2中步骤Ξ的结果判断原则，对29株菌的结果进行判断，从29株菌中 顺利检出20株N. perennans阳性、8株N. a化a阳性、1株N. Kienholzii阳性。
[008引 实施例5
[0089] 本实施例提供了一种检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的试剂盒，至少包括 如W下序列所示的引物和探针组：SEQIDNO:1、沈QIDNO:2、沈QIDNO:3、沈QIDNO: 4、沈QIDNO:5、SEQIDNO:6。
[0090] 优选的，还可W包括2XThunderbirdProbeqPCRMix、d地2〇、阳性对照、阴性对 照，进一步优选的，还可W包括植物基因组DM提取试剂。
[0091] 利用上述试剂盒检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的具体步骤为：使用植物 基因组DNA提取试剂提取待测样品的DNA，W提取的DNA为模板与引物探针组进行实时巧光 PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，同时设阳性对照、阴性对照，根据反应结果 判断样品中是否含有引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌。
[0092] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合，该 引物探针组合包括以下引物： NeoF：5, -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3r ； NeoR：5, -CCAACTCGGCGGCTTCC-3r ； MAL-P ：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB ； PER-P ：CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-BHQ2 ； ALB-P ：NED-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-BHQ1 ； KIE-P ：HEX-TGACCACTTGATGATCTC-MGB ； 其中，FAM、CY5、NED、HEX为荧光基团，MGB、BHQ1、BHQ2为猝灭基团。2. 用于实时荧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的试剂盒，该试剂盒含有 上述引物探针组合。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg' PCR反应缓冲液中的至少一种。4. 根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照。5. -种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR方法，包括以下步 骤： 1) 提取待检测样品中的DNA ; 2) 以步骤1)中提取的DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应； 3) 分析Ct值。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR反应体系以20 μ L计为： fifeDNA 50 ng, 引物 每条引物的终浓度均为0.5 μηιο?/?ν, 探针 每条探针的终浓度均为0.25 pmol/L, 2xThundcrblrd i^obc qPCR Mix 1.0. μ[， ddH.O 补 Ι?!1'?20μL; 其中，2XThunderbird Probe qPCR Mix 内含 DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、 R0X〇7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR反应条件为：95°C 10分钟； 94°C 15秒，60°C 60秒，共40个循环，每个循环结束后在FAM、CY5、NED、HEX通道下检测荧 光信号。
【专利摘要】本发明提供一种用于同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合，所述引物探针组合的序列分别如SEQ？ID？No.1-6所示。本发明还基于所述引物探针组合建立了同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR方法，可实现对引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测。本发明的实时荧光PCR引物探针组合及检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测提供了更有效的方法。
【IPC分类】C12R1/645, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105331707
【申请号】CN201510796234
【发明人】王卫芳, 林惠娇, 胡学难, 何日荣
【申请人】广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月18日