一株桦褶孔菌及其在烯酰吗啉残留降解中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物领域，是利用微生物的方法降解化学农药残留，涉及一株桦裙孔菌菌株Lenzites betulina Y4962及其在烯酰吗啉农药残留降解中的应用。
【背景技术】
[0002]微生物降解是近年来广泛兴起的使用微生物对农药等有机污染物残留进行生物降解的热点研究领域。该技术通过微生物菌体的降解和吸附作用将有机污染物大分子分解成小分子化合物，并使其丧失生物活性并对环境无害。由于微生物个体小、繁殖迅速、比表面大等特点，它们较之其它生物更易适应环境，并可通过自然突变产生新菌种，产生新的酶系统，获得新的代谢途径，从而可参与对农药等有机污染物的降解与转化作用，因此微生物对降解农药残留具有巨大潜力。
[0003]白腐真菌是一类能够生长在木材基质上，造成木材白色腐朽的一类高等担子菌，产生的非特异性胞外酶系漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)和猛过氧化物酶(Manganese peroxidase)除了能够降解木材中的木质素、纤维素和半纤维素夕卜，还能够有效降解多种环境污染物，包括目前很多种类的多环芳烃、人工合成染料及化学农药。白腐真菌种类丰富，种类间以及相同种类的不同菌株对环境污染物的降解能力具有明显差异，因此获得对化学农药的高效降解菌株并运用于实践，对降低环境中农药残留的危害具有重要意义。烯酰吗啉是专一杀卵菌的杀菌剂，能够破坏卵菌细胞壁膜的形成而使病菌死亡。而作为高等担子菌的桦褶孔菌，由于不具有烯酰吗啉的作用位点，烯酰吗啉对其是无作用效果的。
[0004]本专利是从原始森林的腐木上分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂——烯酰吗啉的白腐真菌桦裙孔菌Lenzites betulina Y4962。实验表明烯酰吗啉不对该菌产生任何抑制和杀灭作用，反而能够在水琼脂培养基中利用烯酰吗啉作为唯一碳源和能源而生长；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌96h能够将混入培养基中10mg/L的高浓度烯酰吗啉降解72%以上。充分说明该菌可以用于水体及农产品表面残留的烯酰吗啉的生物降解。目前尚无利用Lenzites betulina降解烯酰吗啉农药残留研究的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株桦褶孔菌菌株及其在烯酰吗啉残留降解中的应用，该菌株具有在水体残留及表面残留的烯酰吗啉的生物降解的工业化应用前景。
[0006]一株桦裙孔菌菌株，该菌株命名为桦裙孔菌(Lenzites betulina),菌株Y4962,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)；保藏日期是2014年1月24日保藏编号为:CGMCC N0.8783。
[0007]菌丝长势旺盛，菌落初为绒毛状，后为成较致密的毡片状，雪白色，不产生色素；菌落由生殖菌丝和骨架菌丝组成，生殖菌丝薄壁到稍厚壁，直径2-3微米，具有锁状联合分隔，偶尔分枝；骨架菌丝稍厚壁到厚壁，菌丝壁在棉兰试剂中有嗜蓝反应，在碘化钾试剂中无变化，直径1-2.5微米，常见直角分枝；平皿培养3天菌落直径4.5厘米。该菌株的ITS rDNA序列已经提交到GenBank数据库，GenBank登录号KJ845635,该序列与Lenzitesbetulina菌株DSH97_071的基因序列同源性达99%。
[0008]所述桦褶孔菌菌株的培养过程为:将所述的桦褶孔菌菌株Lenzites betulinaY4962菌株的菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基上，在28-30°C，平皿培养基上生长4_5天；解剖刀刮取菌丝，接入液体培养基中，4个培养皿刮取的菌丝接种到装有100ml培养液的250ml锥形瓶中，于28-30°C，140rpm转速条件下振荡培养6_7天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂；
[0009]所述的平皿培养基组成为酵母浸粉10g，琼脂17g，加水至lL，pH自然，于121°C高压灭菌20分钟；
[0010]所述的液体培养基组成为酵母浸粉8-12g，KH2P040.4-0.6g, CuS040.05-0.lg, CaCl20.01-0.02g, MnS040.01-0.02g, Vitamin B1.01-0.02g, Tween 800.4-0.6g, pH 自然，加水定容至1L，于121°C高压灭菌20-25分钟。
[0011]含有烯酰吗啉农药最终浓度大于0到200mg/L的上述培养的培养液，于28_30°C，摇床震荡培养，培养时间96-120小时，进行烯酰吗啉农药可的降解。
[0012]于含有烯酰吗啉农药最终浓度大于0到200mg/L的上述培养的培养液接种桦褶孔菌，以桦褶孔菌为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解烯酰吗啉。
[0013]所述的桦褶孔菌菌株及其在烯酰吗啉残留降解中的应用按如下步骤进行实验:
[0014](1)在桦褶孔菌菌株培养液90_120ml中，加入终浓度8_10mg/L的烯酰吗啉农药，于28-30°C，转速140-160rpm，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的烯酰吗啉农药作为对照组；
[0015](2)每隔24h取样一次，取2-3ml样品置于小口 100ml锥形瓶中，加入乙腈8_12mL，超声提取15min,结束后倒入装有8g Nacl的塑料离心管中，反复颠倒混勻，3500rpm离心5min，静置50min，取上层乙腈于100ml圆底烧瓶中，33_37°C旋转蒸发至近干，2ml正己烷加
0.5ml丙酮清洗圆底烧瓶，倒入送样小瓶中，并重复一次，定容至5ml，取1ml用于GC-E⑶气相色谱分析，计算降解率。
[0016]其降解率(%) = (A_B)/AX100，其中:
[0017]A为对照组烯酰吗啉农药残留值，
[0018]B为经降解菌剂降解后的烯酰吗啉农药残留值。
[0019]以桦褶孔菌为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解烯酰吗啉。
[0020]本发明的优点是:本专利是从原始森林的腐木上分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂-烯酰吗啉的白腐真菌菌株桦裙孔菌(Lenzites betulina),菌株Y4962。该桦裙孔菌是一株具有较高活力，培养方法简单，生长速度快，不易变异的菌株，实验表明该菌能够在水琼脂培养基中利用烯酰吗啉作为唯一碳源和能源而生长，并使烯酰吗啉降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌96h能够将混入培养基中10mg/L的烯酰吗啉降解72%以上，充分说明该菌可以用于水体及农产品表面残留的烯酰吗啉的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景，也可以作为研究白腐真菌对烯酰吗啉农药残留降解机制的模式菌株。
【具体实施方式】
[0021 ] 本发明所提供的降解烯酰吗啉农药