一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及乳糖酸的制备方法，具体涉及一株密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的 方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳糖酸（lactobionic acid)是第三代果酸，其集延缓衰老、保湿、抗氧化和促进机 体更新等多种功效于一身。是目前最好的果酸代用品。由于其本身存在于有机体中，乳糖酸 不存在刺激性问题，具有优异的抗氧化能力，可防止细胞和离体器官受到自由基的伤害；乳 糖酸还可避免细胞膜因氧化而受到的破坏，具有极佳的保水性，是化妆品中的重要组分。乳 糖酸是器官移植缓冲液中的重要组分，和金属螯合后的产物可降低由于离子催化产生的羟 基对组织的损伤。乳糖酸还可增加大环内酯类抗生素的溶解度，如红霉素的乳糖酸水溶液 的溶解度比红霉素高出50-100倍；乳糖酸的钙盐的溶解度较高，可用来补充钙的吸收，也 可用来做葡萄糖酸钙的过饱和溶液。乳糖酸有较强的甜味，可以降低酸味，可作为食品的添 加剂使用。乳糖酸因其和水的高亲和性还可作为洗涤剂的组分。在化妆品中加入乳糖酸， 可抗氧化，抗衰老，高保湿等功效。乳糖酸的CAS登录号：96-82-2。
[0003] 目前乳糖酸的制备方法有化学催化合成法以及微生物转化法。微生物转化法又包 括细菌转化法，真菌转化法。化学催化合成法有许多不利的因素，例如产生多种副产物和化 学污染物，而形成的众多副产物又使分离，纯化步骤变得复杂化。微生物转化法具有很大的 优势，高效，低成本，转化率高，副产物少等优点，但是有些已报道的产乳糖酸的细菌不是安 全菌株，难于用于食品等行业的生产。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供利用真菌将乳糖转化为乳糖酸的方法。具体内容涉及利用密 孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的方法。本发明采用的微生物菌种能够将乳糖转化为乳糖 酸，转化率高、副产物少，通过发酵取得了显著效果。
[0005] 本发明的技术方案；一株密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的菌株，其分类命名为 密孔菌（Pycnoporus sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号 CCTCC NO : M 2015020。
[0006] -种用所述菌株转化乳糖废水制备乳糖酸的方法，以CCTCC NO : M 2015020为出 发菌株，以乳糖废水中的乳糖为转化底物，采用碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，转化 制备乳糖酸，其工艺为：
[0007] (1)菌株：采用CCTCC NO : M 2015020为出发菌株；
[0008] (2)菌株保藏：所用菌种保藏培养基上保存，3-6个月转接一次；保藏培养基：PDA 培养基；
[0009] (3)种子培养：从保藏培养基转入种子培养基活化1次，30°C下，200rmp摇瓶培养 2d ；
[0010] 种子培养基的组分以g/L计为：葡萄糖20,新鲜土豆200,以蒸馏水配制，pH自然；
[0011] ⑷微生物转化：将CCTCC NO: M 2015020菌株添加到发酵培养基中，利用微生物 产的脱氢酶、漆酶将乳糖废水中的乳糖转化为乳糖酸；
[0012] 发酵培养基组分以g/L计为：碳源20-50,有机氮源6-10,无机氮源4-10,磷酸 二氢钾1，硫酸镁0. 3,氯化钙0. 08,七水硫酸锌0. 005,四水硫酸锰0. 0015,六水氯化钴 0. 0015
[0013] 七水硫酸铁0.005。
[0014] 所述碳源为乳糖废水中乳糖，以10% v/v添加，所述氮源为：黄豆粉和磷酸氢二 铵；
[0015] (5)在发酵过程中需要加入弱酸调节pH，优选的是琥珀酸缓冲液。通过添加酸类 物质琥珀酸，使得发酵过程中PH4. 5-4. 8保持恒定，以此提高乳糖的转化率。
[0016] 所述真菌转化乳糖废水制备乳糖酸的方法，转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度 优选为3% -5%，在30°C，200rmp的条件下培养7d。
[0017] 乳糖酸应理解为乳糖酸及其盐类，如乳糖酸钙。
[0018] 检测乳糖酸的方法如下：
[0019] 取发酵液离心，上清液经微孔滤膜过滤（0. 22 μ m)，滤液经HPLC分析。HPLC条件： 高效液相色谱仪日立chromaster;色谱柱：BI〇-RAD Aminex ΗΡΧ_87Η(7· 8X300);流动相 为0. 005Μ H2SO4;检测器：紫外检测器，210nm，柱温：50°C，流速：0. 4mL/min，进样量：10yL， 乳糖酸标样浓度：1%。
[0020] 本发明的有益效果：本发明提供了一种利用真菌转化制备乳糖酸的方法，表明密 孔菌（Pycnoporus sp.)SYBC LlO在加入的乳糖废水为20%v/v(乳糖废水中乳糖浓度为 25 % )时培养7d转化率能达到60 %，加入的乳糖废水为40 % v/v时培养9d，转化率达到 45%〇
[0021] 生物材料样品保藏：密孔菌（Pycnoporus sp.) SYBC LlO已保藏于中国典型培养 物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，简称CCTCC，保藏日期：2015年1月7号，保藏编号 CCTCC NO : M 2015020。
【具体实施方式】
[0022] 通过实验，得到了影响发酵转化乳糖酸产率的主要因素：
[0023] 实施例1.培养基配制过程中加入乳糖对乳糖产量的影响
[0024] 按说明书所述的发酵条件，培养基中加入乳糖废水，发酵液中的乳糖的终浓度 为5%。通过对对乳糖产乳糖酸的检测，发酵7d(纤维二糖脱氢酶在第七天达到稳定期） 发现乳糖酸的产量仅为I. 3g/L。又通过乳糖添加时间对乳糖酸产量的影响发现，乳糖对 pycnoporus sp. SYBC LlO发酵产乳糖酸有抑制作用。故应在发酵一定的时间添加乳糖废 水。
[0025] 实施例2.乳糖添加时间对乳糖酸产量的影响
[0026] 按说明书所述的发酵条件，通过对pycnoporus sp. SYBC LlO在不同发酵时间产乳 糖酸的检测，因乳糖对密孔菌产纤维二糖脱氢酶有一定的抑制作用，经检测CDH的酶活，发 现菌体在第4d开始产酶，第7天达到稳定期，所以从第三天开始加入乳糖废水（乳糖含量 为25% )，使发酵液中的乳糖的终浓度为5%，发酵到第10天停止。
[0027] 表1、乳糖添加时间对转化乳糖酸的影响
[0029] 实施例3底物浓度对转化率的影响
[0030] 起始pH4. 5,温度30°C，200rmp，发酵5天后加入乳糖废水，发酵液中的乳糖含量 为5%，pycnoporus sp. SYBC LlO培养到第10天停止发酵，乳糖转化为乳糖酸的转化率为 71. 6%〇
[0031] 起始pH4. 5,温度30°C，200rmp，发酵5天后加入乳糖废水，发酵液中的乳糖含量 为10%，pycnoporus sp. SYBC LlO培养到第10天停止发酵，乳糖转化为乳糖酸的转化率为 58%〇
[0032] 起始pH4. 5,温度30°C，200rmp，发酵5天后加入乳糖废水，发酵液中的乳糖含量 为15%，pycnoporus sp. SYBC LlO培养到第10天停止发酵，乳糖转化为乳糖酸的转化率为 42%〇
[0033] 起始pH4. 5,温度30°C，200rmp，发酵5天后加入乳糖废水，发酵液中的乳糖含量 为20%，pyCn 〇p〇rus sp. SYBC LlO培养到第10天停止发酵，乳糖转化为乳糖酸的转化率为 30%〇
[0034] 表2底物浓度对转化率的影响
【主权项】
1. 一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法，其特征在于利用分类命名为密 孔菌（Pycnoporussp. )SYBC-L10,保藏编号CCTCCNO:Μ2015020的密孔菌转化乳糖废水 制备乳糖酸，工艺为： (1) 菌种：采用CCTCCNO:Μ2015020为出发菌株； (2) 菌种保藏：所用菌株在保藏培养基上保藏，3-6个月转接一次； 保藏培养基：PDA培养基； (3) 种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化1次，每次30°C下培养4d; (4) 微生物转化：将CCTCCNO:Μ2015020菌株添加到发酵培养基中，利用微生物产的 纤维二糖脱氢酶和漆酶将乳糖转化为乳糖酸； 发酵培养基的组分以g/L计为：碳源20-50,有机氮源6-10,无机氮源4-10,磷酸二氢 钾1，硫酸镁〇. 3,氯化钙0. 08,七水硫酸锌0. 005,四水硫酸锰0. 0015,六水氯化钴0. 0015 七水硫酸铁〇. 005 ; 所述的碳源为乳糖废水中乳糖，所述的氮源为有机氮源黄豆粉，无机氮源为磷酸氢二 铵； 转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为3% -5%W/V，种子液以10%的接种量，接入 添加不同氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，250mL三角瓶装液量为50mL;在28-30°C， 200-220rmp的条件下培养7d，得到含乳糖酸的发酵液； (5) 在发酵过程中通过添加琥珀酸缓冲液，使得发酵过程中pH4. 5-5. 0保持恒定，以此 提高乳糖废水的转化率。2. 根据权利要求1所述一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法，其特征 在于转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为3% -5%W/V，在28-30°C，200-220rpm的条件 下培养7d。
【专利摘要】本发明提供一株用于转化乳糖废水制备乳糖酸的密孔菌，其分类命名为密孔菌(Pycnoporus？sp.)SYBC-L10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO：M2015020。用密孔菌(Pycnoporus？sanguineus)SYBC-L10微生物作为菌种，以乳糖废水为转化底物，添加氮源、无机盐及诱导剂组成发酵培养基，微生物转化制备乳糖酸。在发酵过程中通过添加琥珀酸缓冲液，使得发酵过程中pH保持恒定，提高乳糖废水的转化率，优化条件下转化率达到85％以上。对于乳糖酸的研究，我国在此方面的研究尚属空白。本发明转化的乳糖废水中，根据高效液相色谱法检测其中的乳糖含量为25％左右。CCTCC NO: M201502020150107
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/645, C12P7/58
【公开号】CN105400699
【申请号】CN201510125457
【发明人】廖祥儒, 冯圆圆, 李韵雅, 张永, 蔡宇杰, 管政兵, 樊涛
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年3月23日