免疫结合剂的溶解性优化的制作方法
【专利说明】免疫结合剂的溶解性优化
[00011 本申请是申请号为200980123815.6的分案申请。
[0002]相关申请
[0003] 本申请要求于2008年6月25日提交的、名称为"SolubilityOptimizationof Immunobinders" 的US61/075,692的优先权。
[0004]发明背景
[0005]已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗 剂。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增 加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fc效应子功能的不存在、和由较短的 全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它 们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗 体更容易产生。
[0006] -个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构 域(VL)与重链可变结构域(VH)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的可 变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立的重 组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致蛋白质的 弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。
[0007] 因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性。例如，Nieba，L.等人(Prot.Eng.(1997) 10:435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变的scFv在 细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未显著改变。 此外，在他们的公开物中，他们明确地陈述，他们未观察到改造的scFv的天然蛋白质状态的 任何溶解性的提高，如通过PEG沉淀法所测定的。其中对scFv内的特定氨基酸残基进行定点 诱变的其他研究也已得到报告（参见例如，Tan，P.H.等人（1988)Biophys.J. 75:1473-1482; Worn，A.和Pluckthun，A.(1998)Biochem.37:13120-13127;Worn，A.和Pluckthun，A.(1999) Biochem. 38:8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸残基基于其在scFv结 构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。
[0008]在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区（CDR)移植到已证实具有 有利性质的scFv的构架区内（Jung，S·和Pluckthun，A· (1997)Prot·Eng· 10:959-966)。所得 到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。
[0009] 改造scFv以改善溶解性和其他功能性质中的进展在例如Worn，A.和Pluckthun，A. (2001)J.Mol.Bio1.305 :989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计免疫结合剂 (immunobinder)，特别是具有优良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他类 型的抗体从而赋予改善的溶解性一尤其是天然蛋白质的溶解性的方法。
[0010] 发明概述
[0011]本发明提供了在可变重链区VH中包含溶解性增强基序的免疫结合剂以及改造免 疫结合剂例如scFv抗体以赋予改善的溶解性的方法。在特定的实施方案中，本发明的方法 包括用赋予改善的溶解性的优选氨基酸残基置换免疫结合剂的重链可变区和/或轻链可变 区的序列内的对于溶解性潜在有问题的氨基酸。例如，在某些优选实施方案中，用亲水性残 基置换疏水性残基。
[0012] 优选地，提供的免疫结合剂，在本发明的改造方法中使用的或由本发明的改造方 法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域 抗体(例如Dab)和纳米抗体(Nanobody)也可以根据所述方法进行改造。本发明还包括根据 改造方法制备的免疫结合剂，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。
[0013]在一个方面，本发明提供了免疫结合剂，所述免疫结合剂在重链氨基酸位置12、 103和144(AHo编号）中包含下列溶解性增强基序之一：
[0014] (a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S);
[0015] (b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S);和
[0016] (C)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T);或
[0017] (al)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S);
[0018] (bl)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T);和
[0019] (cl)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S);或
[0020] (a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S);
[0021] (b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T);和
[0022] (c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T);或
[0023] (a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S);
[0024] (b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S);和
[0025] (c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)。
[0026]在另一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，免疫结合剂包含（i)重链可 变区或其片段，其中重链可变区包含Vh构架残基和/或（ii)轻链可变区或其片段，其中轻链 可变区包含I构架残基，所述方法包括：
[0027]A)选择VH构架残基、VL构架残基或VH和VL构架残基中的至少两个氨基酸位置以用 于突变;和
[0028] B)突变选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置，
[0029]其中，如果选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置在VH构架残基中，那么置换 在选自12、103和144(根据AHo编号约定)的一个或多个重链氨基酸位置上，和/或
[0030]其中，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在I构架残基中，那么置换在 选自15、52和147(根据AHo编号约定;在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置15、44和106) 的轻链氨基酸位置上。
[0031]在下文中进一步详细描述选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置以及在选择 的位置处插入的氨基酸残基。下文中所示的氨基酸位置编号使用AHo编号系统;使用Kabat 编号系统的相应位置在本文中进一步描述，并且AHo和Kabat编号系统的转换表在下文的发 明详述中阐述。使用标准单字母缩写代码阐述氨基酸残基。
[0032]令人惊讶地发现，在指定的位置上指定的突变的存在增加了免疫结合剂的总体溶 解性而不对蛋白质的其他功能性质产生负面影响。例如，在scFv的VH中3个增强溶解性的突 变V12S、L144S和V103T组合的情况下，发现所述置换占整个scFv的溶解性的约60%。这与现 有技术中陈述的增加免疫结合剂的表达产量的尝试不同。例如，US6，815，540描述通过减少 链内结构域间界面区域中的疏水性对免疫结合剂进行改进。为了所述目的，鉴定了重链可 变构架中的16个位置，所述位置可单独地用选自10个氨基酸的一个或多个氨基酸置换。发 现产生的突变体的表达产量增加。此外，相同的研究组于1999年，即所提及的美国专利的优 先权日期后3年，发表了论文（参见几1^，3.，!1〇1168861'，4.和？111〇1^1:111111，4.(1997) Prot.Eng. 10 :959-966)，该论文陈述，已在几个研究中报导用更加亲水的残基置换疏水性 表面残基提高了产量。根据该作者，产量的增加归因于正确折叠与错误折叠材料的聚集之 间的改善的动力学分配，同时天然蛋白质的溶解性不受影响，其热力学稳定性也未受到显 著影响。因此，对于本领域技术人员来说很显然的是，Plilckthun等人所提及的溶解性参数 只涉及可溶性表达而非天然蛋白质的总体溶解性。
[0033]附图概述
[0034]当考虑本文的下列详细描述时，本发明将得到更好的理解，并且除上文所述的那 些外的目的将变得显然。此类描述参考附图，其中：
[0035] 图1描述了野生型ESBA105(E105)和其溶解性变体的PEG沉淀溶解性曲线。
[0036]图2描述了野生型ESBA105(E105)及其溶解性变体的热变性曲线图，如在广泛温度 范围（25-96°C)下的热攻击后测量的。
[0037]图3描述了SDS-PAGE凝胶，其显示了在热胁迫条件下温育2周后各种ESBA10 5溶解 性突变体的降解行为。
[0038]图4描述了EP43max和其优化的变体的热变性曲线，如通过FTIR分析测定的。
[0039] 图5描述了 578min-max和578min-max_DHP的热稳定性，如通过FT-IR测量的。
[0040] 图6a和6b说明了通过硫酸铵沉淀测量的578min_max和578min_max_DHP的溶解性。
[00411发明详述
[0042] 本发明涉及用于增加免疫结合剂的溶解性的方法。更具体地，本发明公开了通过 在免疫结合剂中引入改善免疫结合剂的溶解性的氨基酸置换来优化免疫结合剂的方法。本 发明还涉及根据本发明的方法产生的经改造的免疫结合剂例如scFv。
[0043] 为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。除非另外指出，本文中使用的所 有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然 与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下 面描述了适当的方法和材料。本文中提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考资料以 它们的全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材 料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。
[0044]本文中使用的术语"抗体"是免疫球蛋白的同义词。根据本发明的抗体可以是完整 的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结构域， Fv(SkerraA.和Pluckthun，A.(1988)Science240:1038-41)、scFv(Bird，R.E·等人（1988) Science242:423-26;Huston，J·S·等人（1988;Proc·Natl·Acad·Sci·USA85:5879-83)， Fab、（Fab'）2、或本领域技术人员熟知的其他片段。
[0045]本文中使用的术语"抗体构架(antibodyframework)"或"构架"是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环的支架（Kabat，E.A.等人，（1991) Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)。
[0046]本文中使用的"抗体⑶R"或"CDR"是指抗体的互补决定区，其如KabatE.A.等人， (1991)Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)定义的由抗原结合环组成。抗体Fv片段的两个可变结构域中的每一个包含例如3个CDR〇
[0047]术语"单链抗体"或"scFv"意指包含通过接头连接的抗体重链可变区（VH)和抗体 轻链可变区（Vl)的分子。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-Vl-接头-Vh-⑶0H或NH2-Vh_接 头-Vl-C00H〇
[0048]如本文中所使用的，"同一性"是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序 列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果 两个DNA分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖氨 酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的"百分数同一性"是由这两个序 列共有的匹配位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序 列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例