一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 内氏放线菌（是口腔中定植的一种主要的放线菌，它通 过产生6-去氧太洛糖（6-deoxytalose)，将口腔中更多的放线菌和其他细菌黏附在牙釉质 上形成菌斑，菌斑中的细菌分解食物中的糖类产酸，酸化和腐蚀牙釉质形成龋齿，并可和其 他细菌进一步引起牙龈炎和牙周炎。
[0003] 卵黄抗体（immunoglobulinyolk，IgY)是鸟类血液中的免疫球蛋白传递至卵 黄，并在卵孵育过程中和孵育后对幼鸟和幼禽起保护作用的免疫球蛋白，IgY的优势在于： 可与抗原特异性结合，发挥抗菌、抗病毒等多种生物学效应；制备经济简单，产量高；对实 验动物无伤害，满足动物权益保护的要求；稳定性好，具有耐热、耐酸、耐蛋白酶等诸多优 点。随着细菌耐药性的不断出现，应用卵黄抗体技术来发挥抗菌作用正逐渐成为研究热点。
【发明内容】
[0004] 本发明主要目的在于提供一种抗内氏放线菌卵黄抗体，所提供的抗体用于漱口 液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，可以对内氏放线 菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎等口腔疾病起到一定的预防和治疗作用。
[0005] 本发明所采取的详细技术方案如下所述。
[0006] -种抗内氏放线菌卵黄抗体，通过以下步骤制备而成： (一） 制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌 体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1X1〇7~1X10 ^CFU/mL 备用； 所述内氏放线菌采用血琼脂平板或用脑心浸液（brainheartinfusion，BHI)琼脂培 养基进行培养，培养条件为37°C、厌氧培养； 所述内氏放线菌具体采用例如美国模式培养物集存库（AmericanTypeCulture Collection)的保藏号为ATCC12104 的内氏放线菌（A.naeslundii); 所述内氏放线菌菌体灭活采用例如质量分数为〇. 2~0. 5%的甲醛进行灭活； (二） 免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤(一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按 1 :1体积比充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2~3 mL； 免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所搜集鸡蛋均于4°C保存；可持续收集鸡蛋60天； 所用蛋鸡具体采用例如22周龄健康产蛋来杭母鸡（1600±230g); 所述免疫接种可具体接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接 种，以后每隔9~14天免疫接种一次；第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三 次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂； (三）分离纯化卵黄抗体，具体过程为： 首先取步骤（2)中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分离蛋清 与卵黄，收集卵黄；对所收集的卵黄，按卵黄：双蒸水=1 :9的质量比加入无菌双蒸水，搅拌 充分混匀后，调节pH值至5. 0~5. 3,4°C静置过夜；然后4°C、10000~12000rpm离心20min， 收集上清液； 对所收集的上清液采用滴加（NH4) 2 304溶液方法获得卵黄抗体，具体过程为： 对所收集的上清液滴加饱和（NH4) 2S04溶液，使混合液中（NH4) 2 §04饱和度为50%， 4°C静置过夜；4 °C、10000rpm离心20~30min，弃上清，对沉淀物用蒸馏水溶解后，滴加 饱和（NH4) 2 304溶液使饱和度达33%，4°C静置过夜； 过夜后，4 °C、10000rpm离心20~30min，弃上清；对沉淀物（即采用滴加（NH4) 2 304溶液方法获得卵黄抗体）用蒸馏水溶解后，经100KD超滤膜超滤纯化，收集浓缩液，冷冻 干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体，所得抗体_80°C保存。
[0007] 所述抗内氏放线菌卵黄抗体在口腔疾病预防与治疗中的应用，可对内氏放线菌、 黏性放线菌或其所形成的生物膜具有一定的预防和治疗作用，能够抑制生物膜的产酸；具 体而言， 抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25Pg/mL，对黏性放线菌的MIC为20〇M<g/mL ; 抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为50mg/mL，对黏性放线菌MBEC为80〇M<g/mL ; 为抑制生物膜内细菌产酸，针对内氏放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小 于12. 5Pg/mL，针对黏性放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于200Pg/mL。
[0008] 经过实际检验，本发明所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的 生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制 备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。
[0009]总体而言，本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体具有容易制备、成本低廉等优 点，将其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料 时，对于内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎的预防和治疗具有较好地应用效果。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0011] 实施例1 本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体，其制备方法包括抗原制备、免疫注射产蛋母 鸡、收集鸡蛋分离纯化抗体等步骤，详细介绍如下。
[0012] (-）制备灭活的内氏放线菌作为抗原 具体过程如下： 取内氏放线菌进行培养，本实施例具体采用购买于美国模式培养物集存库（American TypeCultureCollection)的保藏号为ATCC12104 的内氏放线菌（A.naeslundii); 培养时采用血琼脂平板(也可采用脑心浸液（brainheartinfusion，BHI)琼脂培养 基）； 培养条件为：37 °C、厌氧培养4~6天； 培养结束后，在平板上加入适量无菌生理盐水，用涂布器刮下菌苔和菌落，然后吸入离 心管中，混匀； 将离心管5000~6000rpm、4°C，离心15~20min，弃上清，用0. 2~0. 5%甲酸(质量分 数）灭活18~24h，然后5000~6000rpm，4°C，离心15~20min，弃上清； 用生理盐水洗涤，具体过程为：在上述去除甲醛的离心管中加入生理盐水，混匀后， 5000~6000rpm、4°C、离心15~20min，弃上清；重复此过程不少于3次以确保完全将甲醛 洗去； 在上述生理盐水洗涤后的离心管中再次加入适量生理盐水，用麦氏比浊法测定并调整 细菌悬液浓度为1X1〇7~1X10tFU/mL备用。
[0013](二）免疫接种蛋鸡 取步骤(一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按1 :1体积比充分混合后，皮下和肌 肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2~3mL; 本实施例中所用佐剂均为美国Sigma公司产品，所用蛋鸡为22周龄健康产蛋来杭母鸡 (1600±230g)，购自吉林农业大学养鸡场。
[0014] 本实施例中免疫接种时共接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2 次免疫接种，以后每隔9~14天免疫接种一次； 第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗 氏不完全佐剂。
[0015] 本实施例中共免疫接种10只蛋鸡。4次免疫接种元成后2周开始收集鸡蛋，所搜 集鸡蛋均于4 °C保存；持续收集鸡蛋60天。本实施例中共收集鸡蛋436枚。
[0016] 上述免疫接种过程中，采用相同方法、相同步骤对相同数量的蛋鸡接种生理盐水， 按照相同程序收集鸡蛋并保存作为阴性对照。
[0017](三）分离纯化卵黄抗体 具体包括以下步骤： 首先取步骤（2)中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分离蛋清 与卵黄，本实施例中所采用了 10枚鸡蛋； 其次，将所收集的卵黄打散后，按卵黄：双蒸水=1 :9的质量比加入无菌双蒸水，搅拌充 分混匀后，用0.1mol.L-1HCL调节pH值至5.0~5.3,4°C静置过夜； 第三，将上述过夜后卵黄-双蒸水混合液4°C、10000~12000rpm离心20min，收集上清 液，本实施例中共收集到上清液1200mL; 第四，对第三步中所收集的含有卵黄抗水溶性成分（watersolublefraction，WSF)体 的上清液滴加饱和（NH4) 2S04溶液，滴加量于上清液体积相同（S卩1200mL)，滴加后混合液 中（NH4) 2 §04饱和度为50%，然后4°C静置过夜； 第五，对第四步中静置过夜后混合液离心，4 °C、10000rpm离心20~30min，弃上清； 对沉淀物用等体积（1200mL)的蒸馏水溶解后，滴加饱和（NH4) 2 304溶液使饱和度达33%， 4 °C静置过夜； 第六，对第五步中静置过夜后混合液离心，4 °C、10000rpm离心20~30min，弃上清； 对沉淀物用适量蒸馏水溶解(本次使用1500mL)，然后使用截留分子量为100KD超滤膜的默 克密理博Labscale小型切向流超滤仪(德国Merck公司）进行超滤纯化，收集浓缩液，冷冻 干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体，所得抗体_20°C保存。本实施例中共制得抗内 氏放线菌卵黄抗体653. 8mg。
[0018] 实施例2 对于实施例1所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体，发明人对其抗抗菌活性进行了进一步 测定，相关过程简要介绍如下。
[0019] 对于实施例1中所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体，为检测及使用方便，需制备成 一定浓度的水溶液，具体为：取实施例1中所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体l〇mg，溶于10mL 无菌生理盐水中，制成lmg/mL的母液，经0.22μπι无菌滤器过滤，备用；母液根据需要添加 生理盐水后稀释成相应浓度后再具体使用。
[0020] 最低抑菌浓度（minimumi