nhibitoryconcentration,MIC)的测定 本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体主要是对内氏放线菌、黏性放线菌等感染菌种 具有一定的抑制作用，相关抑菌浓度测定过程如下。
[0021] 首先制备相应感染菌的细菌悬液，具体为： 分别取内氏放线菌、黏性放线菌、变异链球菌的菌株分别接种于血琼脂平板，37°C厌氧 培养4天，然后挑取菌苔或菌落混勾于脑心浸液（brainheartinfusion，BHI)液体培养基 中进行培养，采用麦氏比浊法测定细菌悬液浓度至5.ΟΧΙΟ6CFU/mL时，备用； 所用内氏放线菌（A.naeslundii，ATCC12104)、黏性放线菌（A.viscosus，ATCC19246)、变异链球菌（Streptococcusmutans，ATCC25175)均购于美国模式培养物集存库 (AmericanTypeCultureCollection)； 然后采用试管二倍稀释法进行具体的最低抑菌浓度（MIC)的测定，具体过程为： 取9支灭菌试管并编号，分别加入BHI液体培养基lmL，在第1号试管中加入含80〇μ8/mL的抗内氏放线菌卵黄抗体的ΒΗΙ液体培养基lmL，混匀后吸取lmL加入第2号试管，依此 类推，直至第7号试管，第7号试管吸取lmL弃去，使1~7号试管内抗内氏放线菌卵黄抗体 浓度分别为：400Kg/mL、200Kg/mL、100Kg/mL、50Kg/mL、25Kg/mL、12. 5Kg/mL、6. 25Kg/mL ; 分别向1~8号试管中加入10〇μL感染菌的细菌悬液，混匀，第8号试管为阳性对照，以 观察细菌生长情况，第9号试管不加菌液，为阴性对照，37°C厌氧培养24h，观察结果，重 复实验3次。
[0022] 结果判断：与对照管进行浊度对比，以肉眼观察无细菌生长现象的试管内抗内氏 放线菌卵黄抗体的最低浓度为MIC。
[0023] 结果显示，抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25Pg/mL，对黏性放线菌 的MIC为20(^g/mL，对变异链球菌无抑制作用。这一结果表明，本发明所提供的抗内氏放线 菌卵黄抗体对内氏放线菌有较好的抑菌效果，而对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性，但 对菌种的抗菌作用相对较弱，而且对变异链球菌无抑制作用。
[0024] 抗内氏放线菌卵黄抗体的单菌最小生物膜清除浓度（minimumbiofilm eradicationconcentration，MBEC)的测定 首先，同上述最低抑菌浓度测定过程，分别制备内氏放线菌、黏性放线菌的菌悬液，调 整细菌悬液浓度为4X106CFU/mL备用； 然后，进行最小生物膜清除浓度（MBEC)的测定，具体过程为： 取96孔板，每孔加入15〇μL含1%蔗糖的BHI液体培养基和5〇μL的细菌悬液，37 °C、 厌氧培养24h使形成生物膜； PBS洗板，然后每孔分别加入20〇μL的含抗内氏放线菌卵黄抗体（浓度分别为12. 5Pg/ mL、25M"g/mL、5〇M"g/mL、100M"g/mL、200M"g/mL、400M"g/mL、800M"g/mL)的ΒΗΙ液体培养基，每一 浓度做3复孔，37°C、厌氧培养24h; 培养结束后弃上清，PBS洗板2次，室温干燥30min，然后每孔加入20〇μL的0. 1%结晶 紫，振荡培养20min后，吸出结晶紫，PBS洗板3次，室温干燥，每孔加20〇μL的95%乙醇，振 荡培养1h，将每孔中的乙醇转移至另一 96孔板中，酶标仪测OD57。值，实验重复3次，取平 均值作为测定结果。
[0025] 结果判断：MBEC值为0D57。值突然升高前的临界值。
[0026] 结果显示，抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为5(^g/mL，对黏性放线 菌MBEC为80(^g/mL。需要解释的是，菌斑生物膜是龋齿发生的起始因素，与游离的细菌相 比，菌斑生物膜内细菌的耐药性、毒力和抵抗宿主免疫防御能力更强。上述生物膜MBEC的 实验结果表明，抗内氏放线菌卵黄抗体能渗透单菌生物膜并抑制和杀死膜内内氏放线菌， 在较高浓度下对黏性放线菌也有一定作用。
[0027] 抗内氏放线菌卵黄抗体对单菌生物膜产酸水平的影响 首先，同上述最低抑菌浓度测定过程，分别制备内氏放线菌、黏性放线菌的菌悬液，调 整细菌悬液浓度为4X106CFU/mL备用； 然后，进行抗内氏放线菌卵黄抗体对单菌生物膜产酸水平评价，具体过程为： 取96孔板，每孔加入pH=7. 0的含1%蔗糖的4mL的BHI液体培养液和lmL细菌悬液， 37°C、厌氧培养24h，使形成生物膜； 然后吸出每孔中液体，再分别加入含MBEC(对于内氏放线菌为5(^g/mL，对于黏性放线 菌为80(^g/mL)、1/2MBEC、1/4MBEC和1/8MBEC浓度的含抗内氏放线菌卵黄抗体的BHI液体 培养液5mL，并设阴性对照孔，37°C、厌氧培养24h; 培养结束后把培养液吸入离心管内，4°C、9000rpm、离心20min，测上清pH值，并计算ΔpH值，ΔpH值=初始pH值一终末pH值； 每菌株做6孔，实验重复3次，实验结果采用SPSS19. 0统计软件处理。
[0028] 产酸水平变化结果如下表所示：
表中表示ΔρΗ值显著低于阴性对照组，P〈0. 05。
[0029] 细菌对牙齿的致龋性与其产酸性相关。从上表数据可以看出，抗内氏放线菌卵黄 抗体在MBEC、l/2MBEC和1/4MBEC三个浓度时均可抑制生物膜内细菌的产酸能力，而且抗 体的浓度越高，其抑制生物膜内细菌的产酸能力就越强。
[0030] 综上所述，本发明所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的生 长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制备 的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。
【主权项】
1. 一种抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤： (一） 制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌 体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1X1〇7~1X10 ^CFU/mL 备用； (二） 免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤(一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂充 分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2~3mL; 免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所收集鸡蛋均于4°C保存； (三） 分离纯化卵黄抗体，具体过程为： 取步骤（2)中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳消毒清理后，打蛋收集卵黄，加入无菌双蒸水 搅拌充分混匀后，调节pH值至5. 0~5. 3,4°C静置过夜；然后4°C、10000~12000rpm离心 20min，收集上清液； 对所收集的上清液采用滴加（NH4) 2S04溶液方法获得卵黄抗体； 对所获得卵黄抗体用蒸馏水溶解后，经超滤纯化后，收集浓缩液，冷冻干燥后即得到纯 化的抗内氏放线菌卵黄抗体。2. 如权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(一）中所 述内氏放线菌采用血琼脂平板或用脑心浸液琼脂培养基进行培养，培养条件为37°C、厌氧 培养。3. 如权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(一）中所 述内氏放线菌采用美国模式培养物集存库保藏号为ATCC12104的内氏放线菌。4. 如权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(一）中所 述内氏放线菌菌体采用质量分数为0. 2~0. 5%的甲醛进行灭活。5. 如权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(二）中所 述蛋鸡为22周龄健康产蛋来杭母鸡。6. 如权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(二）中所 述免疫接种具体接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接种，以后 每隔9~14天免疫接种一次；第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四 次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂。7. 利用权利要求1~6任一项所述方法制备所得的抗内氏放线菌卵黄抗体。8. 权利要求7所述抗内氏放线菌卵黄抗体在制备预防与治疗口腔疾病药物中的应用， 其特征在于，针对内氏放线菌、黏性放线菌或其所形成的生物膜具有作用。9. 如权利要求8所述抗内氏放线菌卵黄抗体在制备预防与治疗口腔疾病药物中的应 用，其特征在于， 抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25Pg/mL，对黏性放线菌的MIC为20〇M<g/mL; 抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为5(^g/mL，对黏性放线菌MBEC为80〇M<g/mL; 为抑制生物膜内细菌产酸，针对内氏放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小 于12. 5Pg/mL;针对黏性放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于200Pg/mL。
【专利摘要】本发明属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法。抗内氏放线菌卵黄抗体的制备过程，具体包括：制备灭活的内氏放线菌作为抗原、免疫接种蛋鸡、分离纯化卵黄抗体等步骤。经过实际检验，本发明所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。本发明具有容易制备、成本低廉等优点，将其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，对于内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎的预防和治疗具有较好地应用效果。
【IPC分类】A61K39/395, C07K16/02, A61P31/02, A61P1/02, C07K16/12, A61P31/04
【公开号】CN105418759
【申请号】CN201510882988
【发明人】刘英杰, 李瀚源, 陈娟, 刘云
【申请人】河南大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月7日