口蹄疫病毒a型抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及口蹄疫病毒抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗，具体为口蹄疫病毒A型 抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒A型疫 苗。本发明还涉及上述抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗的制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物传染病。 口蹄疫主要侵害偶蹄类动物，其临床诊断特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。成年 动物感染口蹄疫后一般致死率不高但其发病率可达100 %，发病动物的口、蹄部会出现大量 水疱，精神沉郁，进而使得畜产量锐减。幼畜感染口蹄疫后则经常会不见症状地猝死，严重 时致死率可达1〇〇%。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，因此每次爆发后只能屠 宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患，从而给畜牧产业造成巨大的经济损失。
[0003] 口蹄疫病毒是口蹄疫的致病原，其属于细小核糖核酸病毒，具有多血清型、高变异 性等特点。已知口蹄疫病毒目前有0、A、C、SAT1 (南非I型）、SAT2 (南非II型）、SAT3 (南 非III型）和Asial(亚洲I型）7个主要血清型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚 型已有70多种。口蹄疫病毒各型之间的抗原性常常不同，彼此之间不能交互免疫，而且在 同一种血清型中抗原变异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可 能对同一血清型中的另一种亚型却没有保护。
[0004] 我国口蹄疫流行病学研究表明，我国目前处于流行病毒多元化时期，不同血清型， 不同遗传谱系、不同进化阶段的病毒混杂存在，各自循环，形成了复杂难解的防疫局面。
[0005] 20世纪我国A型口蹄疫疫情感染动物均为牛羊，未见猪发病的临床案例。21世纪 以来我国发生了 3次A型FMD疫情。分别是2003年青海疫情、2009年武汉疫情、2013年广 东疫情。前两次疫情主要感染牛羊，偶尔有猪发病，而2013年首起疫情发生于猪场，其余 发生于牛。因此，本次流行毒株能感染猪。该毒株与历史毒株AF/72同源率为81.6%;与 2009年武汉毒株同源率为91. 5% ;与2004年越南流行毒株同源率大于93. 7%，表明此次 A型FMD流行毒株由境外传入。目前，我国A型口蹄疫的主要是亚洲型东南亚97 (Sea-97) 毒株，结合世界口蹄疫参考实验室的分析结果，2008~2012年间，A型口蹄疫亚洲型流行毒 株可以分为2个进化分支，两个分支间的流行毒株VP1序列同源性在90 %左右，同一分支内 流行毒株VP1序列同源性在95%以上。国家口蹄疫参考实验室分析认为，2009年以来我国 发生A型口蹄疫属于G1分支，而新出现的广东茂名猪A型口蹄疫病毒属于G2分支。我国 周边国家俄罗斯、哈萨克斯坦在2013年也报道发生了A型疫情。本次流行的A/Sea-97/G2 毒株对猪、牛都有致病性，且在牛上，毒力高于2009年湖北武汉A型流行毒株约10倍。目 前，我国尚且没有针对猪A型口蹄疫的疫苗，为了防止新出现的A型口蹄疫流行毒株在我国 猪群中暴发，需要早做准备，尽快生产猪A型口蹄疫疫苗。
[0006] 国家口蹄疫参考实验室分子流行病学监测结果表明：当前在我国猪群中存在0型 和A型口蹄疫病毒，0型口蹄疫病毒主要有3个拓扑型毒株流行（图1为我国0型口蹄疫毒 株遗传分类地位），即新猪毒（分属CATHAY拓扑型）、泛亚毒（分属ME-SA拓扑型）和緬甸 98毒（分属SEA拓扑型），A型口蹄疫病毒主要有1个拓扑型毒株流行（图2为我国A型口 蹄疫病毒遗传分类地位），即Asia型（亚洲型），代表毒株为A/GDMM/2013毒株。根据口蹄 疫病毒分子流行病学分析表明：口蹄疫〇型病毒中新猪毒谱系和泛亚谱系的核苷酸同源性 仅76~80 %，与Mya98谱系的核苷酸同源性仅在75~76 %，泛亚谱系和Mya98谱系的核苷 酸同源性在84~85%。这种状况下很可能出现同型不同毒株之间的不能完全保护的变异 株，但对我国猪群中危害较大的是緬甸98毒（MYA98)。在此前的中国专利CN102180952A(其 申请日为2011年05月10日，发明名称为"口蹄疫病毒A型抗原多肽、融合抗原多肽及疫 苗"）虽然公开了针对0/MYA98/BY/2010毒株设计的0型抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗， 但该技术方案仅适用于应对0/MYA98/BY/2010毒株本身，加之FMDV血清型的多样性造成了 疫苗在不同血清型病毒感染的动物之间没有保护作用，口蹄疫病毒0型和A型毒株间没有 交叉保护作用，所以〇型抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗的公开完全不能对A型毒株抗原、 融合多肽及疫苗的研制带来工作启示。
[0007] 口蹄疫病毒的高异变性和各血清型之间通常不能相互免疫，所以给口蹄疫的防治 工作带来巨大的困难。目前仍迫切需要提供对口蹄疫病毒具有良好免疫原性的疫苗，理想 的疫苗还应对多种不同亚型的口蹄疫病毒都具有良好的免疫原性，从而可以为牲畜提供广 泛的免疫保护。
【发明内容】
[0008]本发明涉及口蹄疫病毒A型抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/ 或融合抗原多肽的口蹄疫病毒A型疫苗，该抗原多肽和疫苗可使宿主动物产生针对多种不 同谱系口蹄疫病毒的免疫原性，从而为宿主动物提供针对多种不同谱系口蹄疫病毒的免疫 保护。
[0009] 就本发明而言，术语"免疫"是指，以适宜的形式和通过适宜的途径对宿主动物给 与某一抗原后，诱导宿主动物产生针对该抗原的特异性的细胞介导的和/或基于抗体的免 疫应答，例如，抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细 胞、树突细胞的活化，和/或其它细胞应答反应。
[0010] 就本发明而言，术语"免疫原性"是指一种或多种抗原诱导宿主动物产生针对该一 种或多种抗原的特异性的免疫反应的能力。
[0011] 就本发明而言，术语"抗原多肽"是指由两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接 形成的具有免疫原性的肽链结构。本发明的肽链结构可以是直链的，带分支结构的，和/或 带环状结构的。
[0012] 就本发明而言，术语"疫苗"是指含有一种或多种具有机体免疫能力的抗原并被配 制成能向宿主动物给药形式的制剂。将疫苗引入到宿主动物体内后，该疫苗就能激发宿主 动物产生针对该一种或多种抗原的免疫反应。
[0013]就本发明而言，术语"宿主动物"是指能够被口蹄疫病毒侵入并允许口蹄疫病毒在 其体内复制的动物。在某些实施方式中，宿主动物是偶蹄动物。在某些实施方式中，宿主动 物是猪、牛、羊等家畜动物。口蹄疫病毒在宿主动物中的侵入和复制可能使宿主动物产生口 蹄疫的临床特征，也可能不使宿主动物产生任何临床特征。
[0014] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0015] 第一方面，本发明提供一种口蹄疫病毒A型抗原多肽，包含如SEQ ID N0 :1所示的 氨基酸序列：
[0016] SEQ ID NO dVal-Tyr-XfGly-XfSer-XfTyr-Ser-XfXs-Xfs-XfXs-Arg-Arg-Gly-A sp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-X12-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala -Ile-X14-Ala-Thr -X15-I 1θ；
[0017] 其中，)^=Asn或Ser;X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr; X5=Pro或Thr;X6_X7=Gin或Gly-Gly或Ala;X8=Asn或Gly或Thr;X9=Leu或Ser;X10=Ser或ProLeu或Val12=Cys或Ser或Ala13=Phe或Tyr14=Arg或 Gin;X15=Glu或Thr〇
[0018] 优选地，所述口蹄疫病毒A型抗原多肽，包含SEQ ID N0:2至SEQ ID N0:40所示 的任一序列：
[0019] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gl y-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X 14-Ala-Thr-X 15_Ile(SEQ ID N0:2);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或 Thr ;X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu或Ser 10= Ser或 Pro ;Xn= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu或Thr ;
[0020] Val-Tyr-Asn-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala -Arg-Xn-Ala-Ala -Gin-Leu-Pro-X12 -Ser-Phe-Asn-X13 -Gly-Ala-1 le-X14-A la-Thr_X15-Ile ; (SEQ ID NO:3)，其中，X2= Val或Cys或Thr ;X 3= Arg或Lys ;X 4= Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 12= Ser或Ala 13= Phe或Tyr 14= Arg 或Gin ;X15= Glu或Thr ;
[0021] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp -Leu-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe-G ly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQ ID NO：4)；
[0022] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Asp -Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe-G ly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQ ID NO：5)；
[0023] Val-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-Arg-Tyr-Ser-Thr-Thr-Gly-Gly-Gly-Arg-Arg-Gly-A sp-Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Val-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-Phe-Gl y-Ala-Ile-Gln-Ala-Thr-Thr-Ile(SEQ ID NO：6)；
[0024] Val-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp -Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-Tyr-G ly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQ ID NO：7)；
[0025] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly -X^-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pro-X^-Ser-Phe-Asn-X^-Gly-Ala-Ile-X!^ Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:8);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr; X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala ;X 8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ; Xn= Leu或Val ;X 12= Cys或Ser或Ala ;X 13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或Thr；
[0026] Val-Tyr-Ser-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:9);其中，X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu 或Thr ;
[0027] Val-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly -X^-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pro-X^-Ser-Phe-Asn-X^-Gly-Ala-Ile-X!^ Ala-Thr_X 15-Ile(SEQ ID N0:10);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr; X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala ;X 8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ; Xn= Leu或Val ;X 12= Cys或Ser或Ala ;X 13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或 Thr；
[0028] Val-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly -X^-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pro-X^-Ser-Phe-Asn-X^-Gly-Ala-Ile-X!^ Ala-Thr_X 15-Ile(SEQ ID N0:11);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr; X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala ;X 8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ; Xn= Leu或Val ;X 12= Cys或Ser或Ala ;X 13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或 Thr；
[0029] Val-Tyr-Asn-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:12);其中，X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu 或Thr ;
[0030] Val-Tyr-Asn-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:13);其中，X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu 或Thr ;
[0031] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-X4-X 5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-G ly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr-X 15-Ile(SEQ ID N0:14);其中，X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr;X6-X7=Gln 或Gly-Gly或Ala ;X8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ;X Leu或 Val ;X13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或Thr ;
[0032] Val-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-Lys-Tyr-Ser-X4-X 5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-G ly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile- X14-Ala-Thr-X15-Ile(SEQ IDN0:15);其中，X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr;X6-X7=Gln或Gly-Gly或Ala ;X8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或 Pro ;X Leu或 Val ;X13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或Thr ;
[0033] Val-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-Arg-Tyr-Ser-X4-X 5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-G ly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr-X 15-Ile(SEQ IDN0:16);其中，X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr;X6-X7=Gln或