，从树脂上切落被保护的肽，脱去保护基即可得 到目标多肽。
[0064] 本发明的多肽也可以通过液相合成方法制备，例如可以用标准的溶液肽合成法制 备，该方法已详细记载在文献"Ε.SchroderandK.Kubke，〃ThePeptides〃，Vol.l,Academic PreSS(NeWYork), 1965"中。在此通过引用方式将该文献全文并入到本申请中用作参考。 液相合成法主要包括，利用形成酰胺键的化学或酶方法分步偶联氨基酸或肽片段。基因 工程方法为利用编码相应抗原多肽或融合抗原多肽的核酸序列在适合的宿主细胞中表达 生成相应抗原多肽或融合抗原多肽的方法。有关该方法的详细描述可参考"Sambrook， Fritsch&Maniatis，MolecularCloning：AlaboratoryManual(第 2 版，ColdSpring HarborLaboratory，1989) '，。
[0065] 第三方面，本发明提供一种口蹄疫病毒A型融合抗原多肽，所述融合抗原多肽包 含大于等于两条权利要求1所述的抗原多肽。
[0066] 本发明提供了一类包含两个或更多个本发明的抗原多肽的融合抗原多肽。融合抗 原多肽所包含的多个抗原多肽彼此之间共价或非共价连接。共价连接例如可以是通过酯 键、醚键、磷酸酯键、酰胺键、肽键、二酰亚胺键、碳-硫键，或者碳-磷键相互连接。非共价 连接例如可以是通过离子间的相互作用力、疏水作用，或者氢键相互连接。
[0067] 融合抗原多肽所含的多个抗原多肽通过连接链连接。就本发明而言，术语"连接 链"是指，用于共价或非共价连接相邻的两个多肽序列的结构单元，该结构单元的引入不会 对融合抗原多肽的免疫原性产生损害。连接链可包括一个或多个氨基酸残基，连接链还可 以包括例如Ci-Q烷基、c3-c6环烷基、芳基或杂芳基等结构。现有技术披露了一些已知的连 接链，本领域技术人员可以根据需要容易地加以选择。
[0068] 融合抗原多肽中所用的连接链由一个或多个赖氨酸，丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸和/ 或脯氨酸或其任意组合组成。例如连接链由1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个， 10个或更多个前述氨基酸或其任意组合组成。融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多 个赖氨酸组成的短肽，例如短肽序列Lys，LysLys，LysLysLys，LysLysLysLys，LysLys LysLysLys，LysLysLysLysLysLys。融合抗原多肽中所用的由一个或多个赖氨酸 组成的连接链包括一个或多个赖氨酸。融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个 赖氨酸和丙氨酸混合组成的短肽，例如LysAlaLys，AlaLysAla，LysAlaAlaLys，Ala LysLysAla,LysLysAlaLys,AlaLysAlaLys,LysLysAlaLysLys或者LysAla LysLysAlaLys。融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个脯氨酸，和/或丝氨酸和 / 或甘氨酸混合组成的多肽，例如ProSerPro，SerProSer，SerSerPro，ProProSer， GlySerGly,SerGlySer,SerSerGlySer,GlyGlySerGly,GlySerGlySer,Gly SerGlySerSer，GlyGlyGlyGlySer〇
[0069] 融合抗原多肽所包含的抗原多肽数量例如可以是2个，3个，4个，5个，6个，7个， 8个，9个，10个或者更多个。融合抗原多肽中所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不 相同的。
[0070]融合抗原多肽包含的抗原多肽可以是天然的口蹄疫病毒抗原多肽序列，也可以是 人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。在本发明的一个实施方式中，融合抗原多肽包含一个或 多个本发明提供的抗原多肽序列和一个或多个天然抗原多肽序列。例如，融合抗原多肽包 含一段本发明提供的抗原多肽序列和一段天然抗原多肽序列。又例如，融合抗原多肽包含 至少一段本发明提供的抗原多肽序列和至少一段天然的抗原多肽序列。
[0071] 在本发明的另一个实施方式中，本发明的融合抗原多肽包含口蹄疫病毒多聚蛋白 的全部或部分氨基酸序列。已知的A型口蹄疫病毒多聚蛋白的一种天然氨基酸序列含有 213个氨基酸，其氨基酸序列如下：
[0072] Thr-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Ala-Asp-Pr〇-Val-Thr-Thr-Thr-Val-Glu-Asn-T yr-Gly-Gly-Glu-Thr-Gln-Val-Gln-Arg-Arg-His-His-Thr-Asp-Val-Ser-Phe-Ile-Met-As p-Arg-Phe-Val-Gln-Ile-Lys-Pr〇-Val-Ser-Pr〇-Thr-His-Val-Ile-Asp-Leu-Met-Gln-Thr -His-Gln-His-Gly-Leu-Val-Gly-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Phe-Ser-Asp-Leu-Glu-Ile-Val-Val-Asn-His-Thr-Gly-Arg-Leu-Thr-Trp-Val-Pr〇-His-Gly-Ala-Pr〇-G lu-Ala-Ala-Leu-Asp-Asn-Thr-Ser-Asn-Pr〇-Thr-Ala-Tyr-His-Lys-Ala-Pr〇-Phe-Thr-Ar g-Leu-Ala-Leu-Pr〇-Tyr-Thr-Ala-Pr〇-His-Arg-Val-Leu-Ala-Thr-Val-Tyr-Asn-Gly-Thr -Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile-G ln-Glu-Leu-Leu-Val-Arg-Met-Lys-Arg-Ala-Glu-Leu-Tyr-Cys-Pr〇-Arg-Pr〇-Leu-Leu-Al a-Val-Glu-Val-Thr-Ser-Gln-Asp-Arg-His-Lys-Gln-Lys-Ile-Ile-Ala-Pr〇-Ala-Lys-Gln -Leu-Leu(SEQ IDNO:41)。
[0073] 第四方面，本发明提供一种口蹄疫病毒A型融合抗原多肽，所述融合抗原多肽包 含至少一条所述抗原多肽，和选自以下组的一种或多肽序列：T辅助细胞表位、免疫刺激 序列、天然口蹄疫病毒抗原多肽。
[0074] 优选地，所述Τ辅助细胞表位为基于麻疹病毒Τ辅助细胞表位，其包含如下所示的 氨基酸序列：Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val(SEQID N0:42);或，
[0075]Gly-Ile-Leu-Glu-Xi-X^Gly-Ile^-Ala-X^Ile-Xs-Xe-Thr-Glu-Leu-Ile-PheCS EQIDNO:43);其中，Xi=Ser或Thr，X2=Arg或Lys，X3=Lys或Arg，X4=Arg或Lys， X5=Thr或Gly，X6=His或Arg;或，
[0076]Gly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Thr-Glu-Leu-I le-Phe(SEQIDNO:44);或，
[0077]Gly-Ile-Leu-Glu-Thr-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Thr-Glu-Leu-I le-Phe(SEQIDNO:45);或，
[0078]Gly-Ile-Leu-Glu-Thr-Lys-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Thr-Glu-Leu-I le-Phe(SEQIDNO:46);或，
[0079]Gly-Ile-Leu-Glu-Thr-Lys-Gly-Ile-Arg-Ala-Lys-Ile-Gly-Arg-Thr-Glu-Leu-I le-Phe(SEQIDNO:47)。
[0080] 本发明提供了一类包含本发明的抗原多肽和T辅助细胞表位的融合抗原多肽。融 合抗原多肽所包含的抗原多肽和T辅助细胞表位可以分别是一个或多个，例如融合抗原多 肽分别包含1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个抗原多肽和T辅 助细胞表位。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的T 辅助细胞表位可以是相同的也可以是不相同的。相邻的抗原多肽和T辅助细胞表位之间、 相邻的抗原多肽之间或者相邻的T辅助细胞表位之间可以通过其自身氨基酸形成的肽键 连接，亦或通过本发明前述部分提到的其它任意方式相连接，例如通过连接链连接抗原多 肽和T辅助细胞表位。
[0081] 此处述及的T辅助细胞表位是指一抗原上供T辅助细胞识别的氨基酸序列。T辅 助细胞是指一类特定的T细胞，其作用是辅助T杀伤细胞从而使T杀伤细胞与目标抗原或 细胞结合而消灭或杀死该目标抗原或细胞。现有技术披露了一些已知的T辅助细胞表位， 本领域技术人员在了解此目的的基础上可以根据其掌握的技术常识选择合适的T辅助细 胞表位并用在本发明的融合抗原多肽中。τ辅助细胞表位的实例包括但不限于，乙肝病毒表 面和核心抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、破伤风毒素T辅助细胞表位、 麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白T辅助细胞表位、白喉毒素T 辅助细胞表位、镰状疟原虫环孢子体T辅助细胞表位、曼森氏吸虫三糖磷酸盐异构酶T辅助 细胞表位，及大肠杆菌TraTT辅助细胞表位。
[0082] 包含有抗原多肽和T辅助细胞表位的融合抗原多肽的非限定性实例例如是：
[0083]Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-ε-Lys~V al-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-A rg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:48);或
[0084]Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-ε-Lys~V al-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-A rg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:49);或
[0085]Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-ε-Lys~V al-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-Arg-Tyr-Ser-Thr-Thr-Gly-Gly-Gly-Arg-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Val-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-Phe-Gly-Ala-I le-Gln-Ala-Thr-Thr-Ile(SEQIDN0:50);或
[0086]Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val-ε-Lys~V al-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-A rg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:51)，或
[0087]Gly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-ε-Lys-Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pro-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-P he-Gly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:52);或
[0088]Gly-Ile-Leu-Glu-Thr-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-ε-Lys-Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pro-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-P he-Gly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:53);或
[0089]Gly-Ile-Leu-Glu-Thr-Lys-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-ε-Lys-Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pro-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-P he-Gly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:54);或
[0090]Gly-Ile-Leu-Glu-Thr-Lys-Gly-Ile-Arg-Ala-Lys-Ile-Gly-Arg-Thr-Glu-Leu-I le_Phe_ε-Lys_Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Gln-Asn-Arg-Arg-Gl y-Asp-Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe -Gly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQIDN0:55)。
[0091] 本发明提供了一类包含本发明的抗原多肽和免疫刺激序列的融合抗原多肽。融合 抗原多肽所包含的抗原多肽和免疫刺激序列可以分别是一个或多个，例如融合抗原多肽分 别包含1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个抗原多肽和免疫刺激 序列。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的免疫刺 激序列可以是相同的也可以是不相同的。相邻的抗原多肽和免疫刺激序列之间、相邻的抗 原多肽之间或者相邻的免疫刺激序列之间可以通过其自身氨基酸形成的肽键连接，亦或通 过本发明前述部分提到的其它任意方式相连接，例如通过连接链连接抗原多肽和免疫刺激 序列。
[0092]此处述及的免疫刺激序列是指可以增强抗原多肽免疫原性的物质，例如来自细 菌耶尔森氏鼠疫杆菌属的侵染素蛋白（Inv)的结构域（Brett等人，欧洲免疫学杂志， 1993,23:1608-1614)或来自其他耶尔森氏鼠疫杆菌侵染素蛋白中相应区域的免疫刺激类 似物。常用的免疫刺激序列为本领域的已知技术，本领域技术人员可以根据其掌握的技术 常识选择合适的免疫刺激序列并用在本发明的融合抗原多肽中。
[0093]在本发明的另一个方面，本发明提供了 一类同时包含本发明的抗原多肽、T辅助细 胞表位和免疫刺激序列的融合抗原多肽。抗原多肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列在融合 抗原多肽中的数量可以分别是一个或多个，例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个， 9个，10个或更多个。例如，融合抗原多肽包含一个抗原多肽，两个或更多个T辅助细胞表 位，以及两个或更多个免疫刺激序列。又例如，融合抗原多肽包含两个或更多个抗原多肽， 一个T辅助细胞表位，以及一个免疫刺激序列。又例如，融合抗原多肽包含两个或更多个抗 原多肽，两个或更多个T辅助细胞表位，以及两个或更多个免疫刺激序列。相邻的抗原多 肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列之间可以通过本发明前述部分提到的任意方式相连接， 例如通过连接链连接，又例如通过其自身氨基酸之间形成的肽键连接。此处应当理解，融合 抗原多肽中所包含的抗原多肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列可以以任意方式排列，例如 抗原多肽分别与T辅助细胞表位和免疫刺激序列直接连接，又例如T辅助细胞表位分别与 抗原多肽和免疫刺激序列直接连接，又例如免疫刺激序列分别与抗原多肽和T辅助细胞表 位直接连接。
[0094]本发明提供的抗原多肽或融合抗原多肽的肽链可以带有环状结构。所述环状结构 可以通过在肽链的两个或多个氨基酸之间形成共价或非共价连接的方式来形成，例如在 两个或多个氨基酸之间形成二硫键，肽键，碳键（例如C-C或C=C)，酯键，醚键，偶氮键， C-S-C键，C-N-C键或C=N-C键的方式来形成。在本发明的一个实施方式中，抗原多肽或 者融合抗原多肽通过在其自身的两个半胱氨酸之间形成二硫键而形成环状结构。在本发明 的一个实施方式中，包含SEQIDNOs:1-40所示序列的抗原多肽带有环状结构。在本发明 的一个实施方式中，包含SEQIDNOs:1-40所示序列的抗原多肽带有的环状结构由半胱氨 酸间形成二硫键而形成。
[0095]多肽环化可以通过本领域的已知技术来实现，例如可以通过天然方法来对多肽 进行环化处理，或者通过化学合成方法来对多肽进行环化处理从而获得环化结构。文 献"Anwer等人，Int.JPep.ProteinRes. 36:392_399(199〇) " 以及"Rivera-Baeza等 人，Neuropeptides30:327-333(1996) "详细记载了多肽环化的方法，它们在此通过引用方 式全文并入本申请用作参考。
[0096]本发明提供了一种环化度大于85%的抗原多肽和融合抗原多肽。在本发明的一 个实施方式中，本发明提供了一种环化度至少为85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%， 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或者100%的抗原多肽和融合抗原多肽。在 本发明的另一个实施方式中，本发明提供了一种环化度