一种血管生成抑制剂多肽hs-1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种血管生成抑制剂多肽HS-1及其 应用。
【背景技术】
[0002] 目前，癌症已经成为除心血管疾病之外的另一杀手，癌症的治疗方式主要以手术、 化疗和放疗为主、但是化疗药物作用大多是不具有选择性的，广泛分布在体内各个器官，治 疗剂量下对正常组织器官损害很大，虽然患者病情能得到暂时缓解，但是对于患者的生存 质量有着严重的危害，并且疗效都不是很理想。因而开发具有肿瘤特异选择性的化疗药物 成为了研究热点。
[0003] 整合素受体（Integrin)为细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与 细胞、细胞与细胞外基质（ECM)之间的相互作用，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。 整合素受体是由α和β亚基以非共价键结合而形成的跨膜异二聚体糖蛋白，属于I型膜 蛋白，迄今已发现由18种不同的α亚基和8种β亚基组成的24种整合素。
[0004]内皮抑素是能够抑制内皮细胞增殖的一类血管生成抑制剂。内皮抑素是胶原 XVIII的C-端片段，分子量为20kDa，能够特异性抑制内皮细胞的增殖和迀移，减少胶质细 胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各种原发肿瘤。内皮抑素能够与整合素α5β1相互作用， 预示着α5β1可能是endostatin的功能革巴点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种血管生成抑制剂多肽HS-1，多肽HS-1对肿瘤细胞整合 素受体具有特异选择性，有良好的应用前景，多肽HS-1由19个氨基酸组成，其序列为Ser -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp，本发 明的19肽是在内皮抑素序列中的12肽序列Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala -Val-Pro基础上进行的改造，Gly-Arg-Asp(GRD)是与整合素受体配体R⑶功能相似的肽序 列，同样对肿瘤细胞有着特异选择功能，所以将12肽与靶向GRD结合起来，使HS-1具有了 靶向性同时增强了抗肿瘤活性。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] -种血管生成抑制剂多肽HS-1，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本发明的另一方面，血管生成抑制剂多肽HS-1在诊断、预防和治疗肿瘤中的应 用。
[0009] 本发明的另一方面，血管生成抑制剂多肽HS-1的合成方法，包括以下步骤：
[0010] 1)偶联：先将芴甲氧羰酰基-天冬氨酸-rink氨基树脂溶胀于DMF中，接 着用piperdine/DMF溶液脱去Fmoc保护基，用DMF洗涤脱帽子后的树脂，加入原料Fmoc-Arg(tBU)-〇H，缩合剂用HBTU;kaiser法检偶联反应是否完成；重复上述操作，依次偶 联Fmoc-Gly(OtBU) -0H，· · ·FmocGly-OH；Fmoc-Pro(Boc) -〇H；Fmoc-Val(Boc) -〇H.........· · Fmoc-Ser(Pbf)-OH，完成所有直链肽合成后，用甲醇洗涤所得到的peptidylresin，真空干 燥箱里充分干燥；
[0011] 2)树脂与肽的分离裂解：
[0012] ①裂解液的配制：裂解液的配比如下：
[0013]
[0014] ②裂解液配好后，混合均匀，放在冰箱里冷藏，然后将裂解液加入树脂中磁力搅 拌，然后，将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤液，将滤液缓慢滴加到冰无水乙醚中，滴 加完毕后，自然沉降，然后在高速离心机里离心，弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥 箱中干燥，得到干粉粗品；
[0015] 3)纯化：
[0016] 取上述干粉粗品，用0. 1 %TFA/H20溶解。经过滤后，上样到C18制备柱，用HPLC 进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体。
[0017] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0018] 1.本发明利用对整合素受体有特异亲和力的GRD肽片段与血管生成抑制蛋白内 皮抑素的有效序列进行连接，形成了一组全新的多肽药物。
[0019] 2.本发明通过多肽的固相合成得到HS-1。
[0020] 3.产物在体内外的肿瘤摄取实验中体现了高效的肿瘤靶向能力，能够被整合素高 表达细胞系特异吸收，起到靶向治疗的目的。
[0021] 4.在体内药效实验中，本产品对比血管生成抑制剂内皮抑素在抑制肿瘤生长过程 中有显著的提高，能够作为实体肿瘤的特效药物。
【附图说明】
[0022] 图1是激光共聚焦实验观察RhB-HS-Ι与单独RhB对不同肿瘤细胞的摄取（A为 U87MG细胞，B为MDA-MB-231 细胞）
[0023] 图2是HS-1肽近红外荧光探针对不同肿瘤荷瘤小鼠（A为US7MG荷瘤小鼠，B为 MDA-MB-231荷瘤小鼠）的靶向特异性。
【具体实施方式】
[0024] (一）HS-1肽的合成，包括以下步骤：
[0025] 1)偶联：先将Fmoc-ASP-RinkamideMBHAresin(荷甲氧羰酰基-天冬氨 酸-rink氨基树脂）0. 33/2mmol6. 06g溶胀于DMF中，10ml/g树脂，接着用 20%piperdine/ DMF溶液脱去Fmoc保护基（以下称之为脱帽），用DMF洗涤脱帽子后的树脂，加入原料 Fmoc-Arg(tBU)-〇H2. 3g，缩合剂用HBTU1. 44g反应时间30分钟，kaiser法检测，如检测结 果为阴性，说明偶联反应完成，则接下去进行脱帽，时间30分钟，如检测结果仍为阳性，则 说明偶联反应未完成或反应不完全，需要延长偶联时间或重新投料偶联，直至偶联反应完 成。
[0026]重复上述操作，依次偶联Fmoc-Gly(OtBU) -0H，· · ·FmocGly-OH；Fmoc-Pro (Boc)-OH； Fmoc-Val(Boc)-〇H...........Fmoc-Ser(Pbf) -〇H，完成所有直链肽合成后，用甲醇洗涤所得到的 peptidylresin，真空干燥箱里充分干燥。
[0027] 2)树脂与肽的分离裂解：
[0028]①裂解液的配制：裂解液的用量：120ml裂解液（10ml/gpeptidylresin)，裂解 液的配比如下：
[0029]
[0030] ②裂解液配好后，混合均匀，放在〇°C冰箱里，冷藏30min，然后将裂解液加入树脂 中，25°C条件下，磁力搅拌2. 5h，然后，用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤 液。将滤液缓慢滴加到l〇eq体积的冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。然后再 高速离心机里离心10min(4000rpm)，弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥箱中干燥 8_10h，得到3. 4g干粉粗品。
[0031] 3)纯化：
[0032] 取上述干粉粗品lg，用0. 1 %TFA/H20溶解。经过滤后，上样到C18制备柱，用HPLC 进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体，检测液体纯度。把合格的样品混合后旋蒸，最后冻 干机里冻干，得到200毫克的HS-1肽，纯度大于98%。
[0033](二）细胞特异性摄取实验：
[0034] 本发明应用于体外细胞实验的荧光染料为罗丹明B(RhodamineB)，与HS-1 肽通过酰胺键连接，简称RhB-HS-Ι，连接方法具体为取lmg罗丹明B(详见参考文献： JieCao，ShunanWan,JunmeiTian,SiwenLi,DaweiDeng.FastclearingRGD-based near-infraredfluorescentprobesforinvivotumordiagnosis，ContrastMedia Mol.Imaging2012,7390-402)溶于lmlPBS(pH为7. 4)中，加入 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳酰二亚胺盐酸盐N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS)(摩尔比RhodamineB:EDC:NHS =1 : 1.5 : 1.5)，避光反应4h，活化。称取lmmolHS-1肽溶入含有荧光染料Rhodamine B的lmlPBS缓冲液（Ph7. 4)中，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚 糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液（Ph7. 4)作洗脱液，得到纯化的RhB-HS-1，-20°C储存备用。
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