菠萝功能着丝粒抗原多肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物信息学与分子细胞遗传学领域，具体涉及菠萝功能着丝粒抗原多肽及其应用。
【背景技术】
[0002]着丝粒是高等真核生物染色体上重要的功能元件。在细胞有丝分裂和减数分裂过程中负责染色体的均等分离，从而起到确保遗传物质稳定传递的重要作用。因此开展着丝粒方面的研究对于揭示生物体的遗规律具有重要的理论与现实意义。由于着丝粒功能的重要性，人们对着丝粒开展了大量的研究，在细胞学中，我们把着丝粒定义为染色体上的主缢痕区，在观察染色体的形态时，这个区域能够被我们清楚的看到，但是对于着丝粒的具体边界定义较模糊，为了开展进一步的研究，我们需要更清楚的知道着丝粒的结构。随着研究的深入，人们对着丝粒的结构进行了一个更加精细划分，着丝粒由两个结构域组成，即核心结构域和核心结构域两侧的周缘着丝粒异染色质结构域，它们分别行使着丝粒的不同功能，其中核心结构域的功能是组建动粒，附着纺锤丝，参与染色体的迀移，行使着丝粒的主要功能，因此这一区域被人们认为是实际的着丝粒区，人们把它称为功能着丝粒，通过对植物功能着丝粒的研究，人们发现其上存在着一种功能很重要的蛋白即CENH3蛋白，它的作用是能够募集动粒蛋白，因此，它在染色体上存在的区域被认为是着丝粒的区域，它也被作为识别着丝粒功能区域的特殊标记，通过对CENH3位置与大小的研究能够反映着丝粒的位置和大小。目前，免疫荧光技术和染色质免疫共沉淀技术是利用CENH3抗体研究功能着丝粒最好的方法，因此，CENH3基因的鉴定及其特异识别抗体的制备也成为功能着丝粒研究不可或缺的工具。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种菠萝功能着丝粒抗原多肽及其应用，获得菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3的基因序列和由该基因表达得到的氨基酸序列以及得到CENH3蛋白的特异抗体，然后将该抗体用于免疫荧光实验，开展菠萝着丝粒方面的研究，确定菠萝染色体上功能着丝粒的位置和大小以及序列信息，使得其物理图谱信息更加全面，同时还能在菠萝基因组的组装方面提供着丝粒方面的信息。
[0004]为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:
菠萝功能着丝粒抗原多肽，氨基酸序列为MARTKHFSNKPSSRSKKRLQ。根据所得到的菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3的基因核苷酸序列得到相应的CENH3蛋白的氨基酸序列，并根据其中的一段特异的序列人工合成所述菠萝功能着丝粒抗原多肽，以此多肽作为抗原来制备相应的抗体。
[0005]菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]编码所述菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。所述的菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3用于抗体制备。
[0007]首先利用生物信息学序列比对的方法预测得到菠萝CENH3蛋白基因的核苷酸序列，然后根据该序列编码的氨基酸序列N端的一段特异序列合成一条多肽，再用该多肽常规免疫新西兰大白兔，制备抗血清，最后经过抗原亲和纯化得到CENH3蛋白的抗体。由于CENH3蛋白是功能着丝粒上的特异蛋白，所得抗体能特异地识别菠萝的功能着丝粒，可在菠萝的染色质免疫沉淀技术(ChIP)，以及该技术与第二代高通量测序技术相结合(ChlP-seq)上的应用中，结合生物信息学的分析方法，确定菠萝染色体上功能着丝粒的大小和位置以及序列信息。
[0008]方法如下:
1、通过生物信息学软件进行序列比对分析，得到菠萝CENH3蛋白对应的基因核苷酸序列；
2、根据上述核苷酸序列得到菠萝相应CENH3蛋白的氨基酸序列；
3、根据CENH3蛋白与H3蛋白之间的差异，选取CENH3蛋白氨基酸N端的一段特异序列人工合成一条多肽，以此多肽作为抗原；
4、将抗原常规免疫2只新西兰大白兔；
5、制备抗血清，获得抗体；
6、经过免疫荧光检测，结果显示该抗体特异结合菠萝染色体着丝粒部位，证实该抗体为菠萝CENH3蛋白的抗体。
[0009]有益效果
本发明获得的菠萝CENH3蛋白的基因序列和由该基因表达得到的氨基酸序列以及得到CENH3蛋白的特异抗体，经过免疫荧光实验，发现只在着丝粒的位置出现了明亮且清晰的信号，表明本发明所得到的CENH3蛋白的抗体真实且可靠，可以进行后续的使用。
[0010]本发明有利于开展菠萝着丝粒方面的研究，可以在后续的研究中通过菠萝染色质免疫沉淀所获得的DNA原位杂交技术(ChlP-FISH)和染色质免疫沉淀技术相结合的测序技术(ChlP-seq)，获得菠萝功能着丝粒的位置大小以及序列信息，构建和完善菠萝遗传图谱和物理图谱，从而进一步探讨菠萝着丝粒形成与功能行使的机制。
【附图说明】
[0011]图1:菠萝CENH3蛋白抗体的免疫荧光实验_A:菠萝细胞有丝分裂染色体，B:焚光信号，C:合成图。从图中可以看到，本发明获得的抗体产生的荧光信号均在菠萝染色体的着丝粒区域，验证了 CENH3抗体的可用性。
【具体实施方式】
[0012]实施例1菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3序列的获得
根据已知的H3蛋白的序列信息和H3蛋白与CENH3蛋白之间的关系，它们在组蛋白折叠域有高度的同源性，但在N端有明显的差异，使用BLAST同源性搜索，以菠萝的H3蛋白序列作为查询序列，在EST数据库中进行同源性搜索比对，找到了菠萝的CENH3蛋白的全长⑶NA，由此得到了菠萝的CENH3蛋白的基因序列以及CENH3的蛋白序列。
[0013]本发明使用BLAST序列比对的方法，根据CENH3蛋白与H3蛋白之间的关系得到了CENH3蛋白相应的序列信息。
[0014]实施例2:抗原的选择
根据获得的菠萝功能着丝粒CENH3的蛋白序列，通过生物信息学软件比对CENH3蛋白序列与H3蛋白序列，得到菠萝CENH3蛋白氨基酸N端的特异序列(MARTKHPAVRKSKAEPKKKL)，采用这一段序列人工合成多肽，经过HPLC和质谱鉴定，该多肽的纯度在85%以上，并且含量为10-14mg。
实施例3:抗体的制备与评价
1、以上述获得的多肽为抗原。
[0015]2、载体偶联，将合成的多肽偶联到蛋白载体上。
[0016]3、动物免疫，抗血清制备。免疫2只新西兰大白兔，首先要预采血，然后在第0天用完全福氏佐剂+抗原，600~800ug/只，进行初次免疫，在第21天用不完全福氏佐剂+抗原，400~500ug/只，进行第一次加强免疫，在第35天用不完全福氏佐剂+抗原，400~500ug/只，进行第二次加强免疫，在第42天进行血清检测，所需要的抗血清ELISA效价为1:20000，若效价达到要求，在第49天采全血，分离抗血清，如达不到要求，在第49天用不完全福氏佐剂+抗原，200ug/只，进行第三次加强免疫，在第56天进行血清检测，若效价达到要求，第63天采全血，分离抗血清。
[0017]4、抗原亲和纯化，每抗体纯化一只兔子30ml抗血清。得到的抗体经SDS-PAGE检测纯度在90%以上。
[0018]为了进一步确定该抗体能够特异的识别菠萝CENH3蛋白，我们进行了该抗体蛋白的免疫荧光实验和染色质免疫共沉淀所获得的DNA原位杂交实验(ChlP-FISH)，结果显示，在菠萝根尖细胞内，每条染色体的着丝粒区都出现了明亮且清晰的信号，其中中期染色体共有50对信号(见附图)，从而证实了该抗体确实能够特异地识别CENH3蛋白，也证实了本发明的抗原多肽确实能够产生特异的抗体，在后续的研究中，可以通过免疫染色实验，进行菠萝染色体着丝粒的定位和大小的确定，同时构建和完善菠萝的遗传图谱和物理图谱。
[0019]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.菠萝功能着丝粒抗原多肽，其特征在于，氨基酸序列为MARTKHFSNKPSSRSKKRLQ。2.根据权利要求1所述的菠萝功能着丝粒抗原多肽，其特征在于:所述抗原多肽是根据菠萝功能着丝粒CENH3蛋白氨基酸序列N端的一段特异序列合成的一条多肽，菠萝功能着丝粒CENH3蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；编码所述菠萝功能着丝粒组蛋白CENH3的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。3.一种如权利要求1所述的菠萝功能着丝粒抗原多肽用于抗体制备。
【专利摘要】本发明提供了菠萝功能着丝粒抗原多肽及其应用，氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，根据该氨基酸序列的N端的一段特异序列合成一条多肽，用该多肽常规免疫新西兰大白兔，制备抗血清，经过抗原亲和纯化得到CENH3蛋白的抗体，进行该抗体的免疫荧光实验，本发明的菠萝CENH3蛋白的抗体可用于菠萝功能着丝粒位置的细胞学定位，也能应用在与菠萝的染色质免疫沉淀技术相结合的测序（ChIP-seq）上面，确定菠萝染色体上功能着丝粒的位置和大小以及序列信息，开展着丝粒基因组遗传图谱与物理图谱的定位，为着丝粒形成与功能行使机制的研究及其人工染色体的构建提供重要的工具和信息。
【IPC分类】C07K16/16, C07K14/415, C07K16/06
【公开号】CN105418740
【申请号】CN201510950637
【发明人】王凯, 单文波, 韩金磊, 官清娜
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月19日