高效溶磷促生菌、由其制备的生物肥料制剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种高效溶磷促生菌、由其制备的生物 肥料制剂及应用。
【背景技术】
[0002] 磷素是植物生长必需的仅次于氮的大量元素，因土壤的固定作用其有效性很低， 难以满足作物生长需要(Wild，1988)。研究表明，施入土壤的磷肥有90%以上转化为难溶 磷，酸性土壤转化为磷酸铁、磷酸铝，石灰性土壤转化为磷酸钙(Hagin and Hadas，1962; Nagelschmidt G，et al. 1994)。为提高作物产量，磷肥用量剧增，磷矿资源面临耗竭危机。 据估算，全世界磷矿石可以使用60-90年(Runge-Metzger A. 1995)。我国90%以上的耕地缺 磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。 我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。然 而，众所周知，我国磷矿资源缺乏，而且中低品位居多，使用年限仅为20年（陶俊法，2009)。 因此，提高磷肥利用效率，挖掘土壤磷素利用潜力，延长磷矿资源的使用寿命，对我国乃至 世界各国农业可持续发展具有重要意义(Mendes et al.，2013;Kanse et al.，2014)。
[0003] 溶磷微生物通过产生有机酸(Mendes et al.，2014;Li et al. ,2015)、分泌H+质 子(Illmer and Schinner，1995;Bagyaraj et al.2000)将难溶磷转化为有效磷，同时依靠 产生植物促生物质(Hussein and J〇〇,2015)，从而在磷素的生物有效性和作物增产中起到 重要作用。近百年来，溶磷微生物研究一直受到科学家的高度重视，期望通过接种溶磷微生 物制剂提高土壤难溶磷的有效性和磷肥利用效率(Zaidi et al.，2009;Merbach et al.， 2010)。由于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力和接种效果差异悬殊，因此，高 效溶磷菌株的筛选显得尤为重要。
[0004] 目前，溶磷微生物已经作为活化土壤难溶磷，提高磷矿石的生物有效性和作物产 量的有效措施广泛使用(Mittal et al.，2008;Shi et al.，2014)。研究显示，无论在固体 培养基平板还是液体培养条件下，溶磷真菌的效果高于溶磷细菌(Kucey et al.，1983; Khan et al· ,2010)。溶磷微生物具有增加土壤有效磷(Kucey et al.，1989;Shi et al·， 2014;Yin et al .,2015)，促进磷素吸收和减少磷肥用量(Singh and Reddy ,2011 ;Nakayan et al· ,2013)，促进磷矿石的生物有效性(Kucey and Leggett，1989;El_Tarabily et al, 2008 ;KAUR and REDDY, 2015)，以及促进作物生长和提高作物产量的作用(Chuang et al·， 2006;Mittal et al.JOOSAhosh et al.,2015)。已有报道表明，溶磷微生物及其生物肥 料在溶解难溶磷、减少磷肥投入和提高作物产量方面潜力巨大。因此，在溶磷微生物筛选和 应用潜力研究过程中，应该注重选择既有较高溶磷能力，又能提高作物产量的高效菌株。
[0005] 以石灰性土壤为主的农田占我国耕地面积的二分之一，拥有着50 %的粮食产量， 然而，随着产量的逐年提高，导致化肥过量使用。目前，我国政府高度重视化肥减量高效问 题，规划要求在2020年做到化肥零增长。磷肥的过量使用导致江河湖泊的富营养化，需要降 低磷肥使用量、提高磷肥利用率，减少环境进入水体的有效磷数量。同时，为了达到磷肥零 增长的目标，迫切需要生物技术的改进和提升，溶磷微生物无疑成为了首选的环境友好型 的措施。然而报道显示，从石灰性土壤，尤其是从磷肥过量使用的高产石灰性农田土壤筛选 高效溶磷黑曲霉的工作报道较少。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对我国缺磷和磷肥利用率低、增产潜力下降的问题，提供一种 广泛适应性的高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂、生物肥料制剂及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明从我国河北省石家庄市高产农田土壤(石灰性土壤） 中筛选到一株具有较强溶解土壤难溶磷作用的真菌A6,综合菌株的形态特征观察、生理生 化试验、分子生物学测序结果，最终确定菌株A6为黑曲霉(Aspergillus niger)，现已保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC N0.11654,保藏日期2015年11 月17日。
[0008] 本发明还提供含有黑曲霉A6的微生物菌剂;所述菌剂中还含有添加剂、粘结剂和 保护剂。
[0009] 其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、草炭土、稻壳粉、麦壳粉、秸杆粉等中的 至少一种;所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖等;所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物 油、海藻酸钠、纤维素、壳聚糖等中的至少一种。
[0010] 本发明还提供由黑曲霉A6或其菌剂制备的复合微生物菌剂。
[0011]本发明还提供由黑曲霉A6、其菌剂或复合微生物菌剂制备的土壤磷素活化剂。 [0012]本发明还提供由黑曲霉A6、其菌剂、复合微生物菌剂或土壤磷素活化剂制备的生 物肥料制剂。
[0013] 所述生物肥料制剂是将由黑曲霉A6制备的菌剂或土壤磷素活化剂经造粒后，即可 单独作为底肥，可与种子一起作种肥使用，又可以与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥中的至少一 种混合制成生物肥料制剂。
[0014] 本发明还提供黑曲霉A6、其菌剂、复合微生物菌剂、土壤磷素活化剂或生物肥料制 剂在活化土壤难溶磷中的应用。
[0015] 本发明还提供黑曲霉A6、其菌剂、复合微生物菌剂、土壤磷素活化剂或生物肥料制 剂在提高土壤对作物的供磷能力（即提高磷矿粉有效性)中的应用。
[0016] 本发明进一步提供黑曲霉A6、其菌剂、复合微生物菌剂、土壤磷素活化剂或生物肥 料制剂在提高作物产量中的应用。
[0017] 本发明提供的高效溶磷促生菌一黑曲霉A6,具有如下微生物学特性：
[0018] 1、A6菌落在无机磷（磷酸三钙为磷源）培养基上，生长较快，25°C培养5d直径达 2.0-2.5cm，菌落平坦，中央稍凸起，质地丝绒状;分生孢子黄黑色至黑色，呈放射状分布，背 面无色或略带浅灰色（图1)。
[0019] 2、PDA培养基上蔓延迅速，25°C培养7d直径达8.0-8.5cm，起初菌落为白色，随后变 成黑色厚绒状，背面略带灰黄色。分生孢子头黑色呈放射状，分生孢子梗长短不一。
[0020] 3、菌落在察氏琼脂培养基上生长迅速，25°C培养7d直径达9.00cm，菌落平坦，中央 稍凸起，质地丝绒状；分生孢子黄黑色至黑色；分生孢子梗发生于基质，顶囊球形，全面可 育;产孢结构双层;分生孢子球形，直径达4~6μπι，壁具明显尖疣或光滑。
[0021]本发明从我国北方石灰性土壤中筛选到一株适用于石灰性土壤类型、主要作物的 高效溶磷的黑曲霉Α6,特别适合我国华北、西北等区域的典型土壤。实验表明，在固体、液体 培养基条件下，能够溶解Ca3 (Ρ〇4)2、磷矿石、骨粉。通过菌株Α6对石灰性土壤中活化土壤难 溶磷、促进作物生长和提高作物产量的作用效果进行研究，为溶磷微生物在土壤磷转化、磷 矿粉的生物有效性、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了宝贵的菌种资源和技术支 撑。
[0022]本发明的微生物菌剂能够高效溶解磷矿粉，5天溶解率达80.4%，超过目前报道的 溶磷真菌菌株。Α6微生物菌剂显著增强土壤难溶磷的有效性，10天-20天使土壤有效磷提高 8.13-8.95yg/g;盆栽作物吸磷量比对照增加82.01 % ;玉米产量提高15.85 %。本发明的微 生物菌剂对于植物促生效果明显，且其作用效果不受化肥使用的抑制，可以在正常使用化 肥条件下使用，对我国农业生产节约磷肥资源、粮食持续增产和保护农田生态环境具有重 要意义。
[0023]本发明针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并针 对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源的现状，筛选和培育广泛适用我国各类主要土 壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株，为开发高效溶磷微生物菌剂的提供技术支撑。
【附图说明】
[0024]图1为本发明黑曲霉A6菌株在无机磷(磷酸三钙为磷源)培养基上形成的菌落。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0026]实施例1黑曲霉A6的分离及培养
[0027]从我国河北省石家庄市农田土壤(石灰性土壤）中筛选到一株具有较强溶解土壤 难溶磷作用的真菌A6,综合菌株的形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定菌株A6为 黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0028] (1)黑曲霉A6培养基
[0029] 发酵液配方(kg/t发酵液）：磷酸氢二钾0.1kg，磷酸二氢钾0.1kg，氯化钠4.3kg，硫 酸镁0 . lkg，淀粉8.6kg，牛肉膏4.3kg，蛋白胨4.3kg，酵母粉4.3kg，鹿糖8.6kg，硫酸铵 2.6kg，碳酸f丐10kg，硫酸亚铁0.001kg，豆油6.8kg，以水配制。
[0030] (2)黑曲霉A6的培养
[00311将黑曲霉A6菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28~30°C培养48h，然后接入 1000mL三角瓶，在30°C，220r/min下，培养36h ;按5v/v%接种量接入到50L种子罐中，在 220r/min，pH7.5，通气量0.5vvm条件下，培养2d后，再按10v/v %接种量转到500L的发酵罐 中，在200r/min，pH7.5，通气量0.7~1. Ovvm条件下，培养3d。
[0032]发酵完成后，以发酵液1~3倍体积的灭菌草炭土、高岭土吸附，即得溶磷黑曲霉A6 菌剂。
[0033]实施例2高效溶磷促生微生物菌剂的制备
[0034] 1、黑曲霉A6的培养
[0035] (1)培养基的组成(kg/t发酵液）
[0036]可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5k