一种高通量裂解大肠杆菌细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及大肠杆菌细胞作为外源基因重组表达的宿主细胞 及其裂解方法;其本质为当外源蛋白在大量单克隆中同步诱导表达后，快速同步裂解来自 不同克隆的大肠杆菌细胞以测定所诱导表达外源蛋白活性所需的细胞裂解液样品制备方 法。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌细胞是外源基因重组表达最常用的宿主细胞。在筛选重组表达蛋白的突 变体或者表征这些突变体的序列和性质关系时，用大肠杆菌作为宿主细胞进行诱导表达 后，需快速裂解大量克隆的大肠杆菌细胞以测定细胞内诱导表达外源蛋白的活性。对于筛 选酶或抗体类蛋白的突变体库时，更需要高通量的方法快速裂解大量的大肠杆菌细胞克 隆。用微孔板进行裂解是实现高通量同步操作的基本策略。考虑微孔板中裂解的特殊性，用 冻融的方法裂解细胞需多次反复冻融才有足够的裂解效力故操作效率很低，尤其裂解效力 低且对某些不耐受反复冻融的外源蛋白不适用。用多探头超声同步裂解微孔中的多个细胞 克隆裂解效力强且效率很高，但需要特殊的昂贵设备，且每个探头的能量效率差异会造成 裂解效力的显著差异而干扰比较诱导表达外源蛋白的活性。用化学方法裂解细胞重现性 好，无需特殊设备，易于实现高通量裂解，但需要特殊的裂解液。目前所用化学裂解方法常 用溶菌酶在中性条件下温和裂解，但溶菌酶的用量对裂解效力影响很大，用大量的溶菌酶 裂解效力尚但成本很尚。
[0003] 大肠杆菌细胞不耐受碱性缓冲液;用强碱加强的表面活性剂裂解大肠杆菌细胞是 制备质粒的最常规方法;但其所用裂解条件会造成几乎所有的蛋白变性失活。只有筛选到 能保障对所诱导表达外源蛋白活性和稳定性影响低于10%的碱性缓冲液，才能用于通量裂 解大肠杆菌细胞;尤其能筛选到需测定活性外源蛋白能耐受的表面活性剂，则可进一步加 速裂解。
[0004] 大肠杆菌的碱性磷酸酶、各种来源的尿酸酶、绿脓杆菌芳香硫酸酯酶，都能耐受pH 9.0的高浓度缓冲液，且对0.1 %的Tween-20也能耐受。筛选这些酶蛋白的突变体库时，就可 用本发明所述的裂解方法高通量制备大肠杆菌的细胞裂解液，以高通量筛选其突变体库。 对于其它能耐受高浓度碱性裂解缓冲液的酶或蛋白，此高通量裂解方法也适用。
【发明内容】
[0005] 1. -种高通量裂解大肠杆菌细胞的方法，适用于同步裂解不同克隆的大肠杆菌细 胞测定诱导表达外源蛋白活性，其裂解过程特征在于：
[0006] (一)筛选缓冲介质：最适缓冲区间在pH 8.5到10.5之间、室温溶解度不低于0.8M， 包括但不限于三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐、硼酸盐；
[0007] (二)针对在大肠杆菌中诱导表达后需测定活性的外源蛋白，按下述筛选表面活性 剂：
[0008] (1)终浓度不高于0.01%时，对测定大肠杆菌中诱导表达外源蛋白的活性无干扰；
[0009] (2)终浓度不高于0.1 %时，与需测定活性外源蛋白作用3小时对活性影响小于 10% ；
[0010] (3)候选表面活性剂包括但不限于tween-20、NP_40、Triton X-100;
[0011] (4)如筛选不到满足要求的表面活性剂，则以下操作过程中不用表面活性剂；
[0012] (三)制备满足如下要求的候选裂解缓冲液：
[0013] ⑴所选缓冲介质的浓度不低于〇. 8M，其pH在8.5到12.0间；
[0014] (2)满足要求表面活性剂的体积浓度或质量浓度不低于0.01 %但不高于0.3% ;
[0015](四）按下述标准筛选合适的裂解缓冲液：
[0016] (1)需测定活性外源蛋白在所述缓冲液中处理3小时，其活性变化不超过10%;
[0017] (2)缓冲液稀释10倍以后，对测定大肠杆菌中诱导表达外源蛋白的活性影响低于 10% ；
[0018] (3)同时满足上述两项要求的缓冲液，以下简称为裂解缓冲液；
[0019] (五)按如下所述，将裂解缓冲液与大肠杆菌细胞悬液混合并转移到微孔板中：
[0020] (1)所用微孔板上，每个微孔的最大容量不小于0.06ml;
[0021] (2)取不少于10μ1大肠杆菌细胞悬液与不少于5倍体积的裂解缓冲液在微孔板中 直接混合得待裂解混合物;或在试管中先将不少于1〇μ1的大肠杆菌细胞悬液与不少于5倍 体积的裂解缓冲液混合得待裂解混合物，再将不少于〇. 〇40ml待裂解混合物转移到微孔板 中；
[0022] (3)每个微孔中待裂解混合物不超过微孔最大容量的90%但不少于微孔最大容量 的 20 %;
[0023] (六)将微孔板及其待裂解混合物室温持续快速震荡;持续震荡时间不短于2小时， 但不长于需测定活性外源蛋白在裂解缓冲液中活性变化小于10%的最长时间，得到裂解液 样品。
[0024] 2.据权利要求1所述一种高通量裂解大肠杆菌细胞方法，其所用裂解缓冲液适合 但不要求含有非选择性蛋白酶抑制剂;此类蛋白酶抑制剂包括但不限于对氨基苯甲脒和对 甲苯磺酰氟;如含有此类蛋白酶抑制剂，其浓度限制在对外源蛋白的活性和稳定性都无影 响水平。
[0025]应用实施例 [0026]所用材料、试剂和设备
[0027] 绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(PAAS)载体、表达、纯化、活性测定和活性单位定义等见文 献[Liu H，et al .Analytical Sciences，2015;31(5) :421-427]。测定活性所用缓冲液为 1.0M Tris-HCl pH 9.0;底物4-硝基苯基硫酸酯（4NPS)终浓度2.0mM;用405nm吸收监测 PAAS反应，计算从启动反应8. Omin到15min之间的吸收变化速度为初速度，以便用酶标仪测 定;每分钟释放1.0微摩尔的对硝基酚的PAAS活性为一个单位(U)。用北京北川飞虹生物科 技有限公司的M+-NTA-琼脂糖柱纯化后，比活性大于32单位每毫克，变性电泳检测未发现 显著杂蛋白。测定酶活性用MAPADA UV 1600PC分光光度计和Biotek ELX 800酶标仪。其余 未注明的试剂及材料来自阿拉丁、上海生工或者北京鼎国生物等国内公司。
[0028] 应用实施例1:筛选适合高通量裂解诱导表达PAAS后大肠杆菌细胞的表面活性剂
[0029] 1.取转化PAAS表达载体的大肠杆菌细胞BL21(DE3)，用250ml TB培养基在1L培养 瓶中37°C放大培养4小时;加 IPTG到1. OmM在16°C诱导表达20小时；
[0030] 2.2000rpm离心20分钟收集细胞；用50mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液洗涤细胞一 次;再用此缓冲液悬浮到20ml，超声裂解30min;得到PAAS的样品；
[0031] 3.将候选表面活性剂用前述50mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液稀释到10%，并进一