乳杆菌，并于2013年9月11日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 8149。
[0028] 实施例2 2株优良菌种的抗逆性和生物学性能测定 2株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147和干酪乳杆菌CGMCC No. 8149的生物学性能 和抗逆性能测定： 1) 地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147培养物的制备：将冰箱保藏的斜面菌种接种到LB种 子培养基中活化，37°C、lOOrprn培养16h，即得； 2) 干酪乳杆菌CGMCC No. 8149培养物的制备：将冰箱保藏的斜面菌种接种到MRS种子 培养基中活化，30°C、150rpm培养16h，即得； 3) 耐酸性测定：将上述制备的培养物按10%接种量分别接种于pH值2. 0、3. 0、4. 0的 人工模拟胃液中，重新调pH值为2. 0、3. 0、4. 0, Oh计数作对照，3h取样用0. 85%生理盐水按 10倍系列稀释，进行平板活菌计数，计算存活率。
[0029] 本发明选育的2株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147和干酪乳杆菌CGMCC No. 8149在胃酸中存活率结果见表1。
[0030] 人工模拟胃液的制备：量取9. 5%~10. 5%浓盐酸16. 4毫升，加蒸馏水至1000毫升， 做基础人工胃液，用盐酸或氢氧化钠调pH值2. 0、3. 0、4. 0,121°C下蒸汽灭菌15分钟，按1% 添加量添加胃蛋白酶，通过〇. 22 μ m无菌滤膜，制成人工胃液，取5mL (4. 5mL)分装于试管 中。
[0031] 表1 2株菌种在人工模拟胃液中的存活率
4) 耐肠液测定：将上述制备的培养物按5%接种量分别接种于人工模拟肠液中，Oh计数 作对照，3h取样用0. 85%的生理盐水按10倍系列稀释，进行平板活菌计数，计算存活率。
[0032] 本发明选育的2株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147、干酪乳杆菌CGMCC No. 8149在肠液中存活率结果见表2。
[0033] 人工模拟肠液的制备：称取6. 8g，加蒸馏水至1000毫升，做基础人工肠液，121°C 下蒸汽灭菌15分钟，按1%添加量添加胰蛋白酶，通过0. 22 μ m无菌滤膜，制成人工胃液，取 5mL (4. 5mL)分装于试管中。
[0034] 表2 2株菌种在人工模拟肠液中的存活率
5) 耐胆盐测定：将上述制备的3株菌种的培养物，按10%接种量分别接种于0. 03%、 0. 1%、0. 2%、0. 3%不同浓度猪胆盐的LB溶液中，Oh计数作对照，24 h取样用0. 85%生理盐水 按10倍系列稀释计数，进行平板活菌计数，计算存活率。
[0035] 本发明所选育的2株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147、干酪乳杆菌CGMCC No. 8149在胆盐中存活率结果见表3。
[0036] 胆盐的制备：在配好的LB液体培养基中添加0. 03%、0. 1%、0. 2%、0. 3%不同浓度的 猪胆盐，121°C下蒸汽灭菌30分钟，在无菌条件下，分别取5mL 0. 03%、0. 1%、0. 2%、0. 3%不同 浓度的猪胆盐溶液分装于试管中。
[0037] 表3 2株菌种在不同浓度猪胆盐中处理24h的存活率
6) 芽孢杆菌耐高温测定：将上述制备的芽孢杆菌菌种的培养物3500rpm离心30min，去 培养上清液，用0. 85%生理盐水按10倍系列稀释至一定的倍数，分别于85°C、90°C、95°C、 100°C水浴处理3min，流水冷却，以室温下未经水浴的菌株培养作为对照，采用平板计数法 计算水浴后的存活率。
[0038] 表4地衣芽孢杆菌在不同高温处理3min的存活率/%
7) 耐药性测定：采用药敏纸片法。取适量被检细菌的培养物，均匀涂布于营养琼脂表 面，待菌液吸收后，贴上药敏纸片，37培养18h，观察结果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径， 根据直径大小判定细菌对药物的敏感性。
[0039] 表5 2株菌种的耐药性测定结果
8)芽孢杆菌的产酶测定： 采用平板透明圈法。分别在纤维素酶培养基、蛋白酶培养基、淀粉酶培养基、木聚糖酶 培养基和脂肪酶培养基上点种分离的芽孢杆菌，每种处理设3个重复，37°C培养36h，观 察平板透明圈的有无及大小，若在菌落周围形成透明的菌落或者模糊圈，则证明芽孢杆菌 可以产生相应的酶，用游标卡尺分别测量透明圈直径（H)和菌落直径（C)，计算两者比值 (H/C)。
9) 产酸测定： 采用溴甲酚紫平板对干酪乳杆菌CGMCC No. 8149进行有机酸产量测定。菌体产酸则在 菌落周围平板由紫变黄，用游标卡尺分别测量黄色圈直径（H)和菌落直径（C)，计算两者比 值(H/C)。
10) 抑菌试验：采用琼脂打孔扩散法对常见致病菌进行抑菌测定。
[0042] a、在装有10mL营养肉汁培养基的试管中活化两株致病菌：K88、K99,37°C恒温培 养 20h ; b、 取直径90 mm的平板，注入100uL浓度为l*10sCFU/ml指示菌菌液，然后注入温热的 LB固体培养基，混匀后，待琼脂冷却后，用打孔器在琼脂上打四个直径为3_的孔； c、 加样品：在每个孔中加入20uL干酪乳杆菌的发酵液上清液，每个样品2个重复。将 加完样的平板置于37°C恒温箱内，培养16~18h后，取出测量抑菌圈大小。
[0043] 表8干酪乳杆菌对常见致病菌的抑菌结果
实施例3干酪乳杆菌菌粉的制备 1) 平板培养复壮：将干酪乳杆菌菌种接种于MRS平板培养基上，于37°C培养16h，使 干酪乳杆菌菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37°C培养14h ; 2) -级种子的制备：将步骤1)培养的干酪乳杆菌菌种转接装有300ml MRS液态培 养基2L摇瓶里，37°C静置培养18h，至对数后期，得一级种子； 3) 二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子转接到装有75LMRS种子培养基的 100L种子罐中，温度37°C，转速80rpm，培养18h，得二级种子液。
[0044] 4)干酪乳杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照1.5%的接种量 接种到〇. 75m3发酵培养基的发酵罐中，温度37°C，转速80rpm，罐压0. 05Mpa，通风比：1 : 0. 2,培养18h，得到活菌数为4. 6X 109cfu/ml干酪乳杆菌发酵液。
[0045] 所述的发酵培养基为：葡萄糖2%，大豆蛋白胨1.8%，酵母膏1.5%，硫酸铵 0. 75 %，磷酸氢二钾0. 4 %、氯化钠0. 6 %，硫酸镁0. 04 % ; 干酪乳杆菌菌粉的制备：将步骤4)制备的发酵液，4000rpm离心，得到菌泥，加入与 菌泥的质量/体积百分比为20%的冻干保护剂，混匀，于-40°C冷冻干燥，得到水分含量为 4. 5 %的干酪乳杆菌菌粉。
[0046] 冻干保护剂的组成为：脱脂奶粉、甘油、乳糖、玉米淀粉和谷氨酸钠的混合物，按照 脱脂奶粉：甘油：乳糖：玉米淀粉：谷氨酸钠=2 :1 :1 :0. 8的比例混合而成。
[0047] 实施例4地衣芽孢杆菌菌粉的制备 1) 平板培养复壮：将地衣芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于37°C培养24h， 使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37°C培养36h ; 2) -级种子的制备：将步骤1)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养 基上，36°C培养14h，使处于对数后期，得一级种子； 3) 二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有 60L BPY种子培养基的100L种子罐中，温度36°C，转速300rpm，罐压0. 05MPa，通风比：1 :0. 8,培养14h，得二级种子液。
[0048] 4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照1 %的接种量 接种到6m3发酵培养基的发酵罐中，温度30-40°C，转速200rpm，罐压0. 05Mpa，通风比：1 :0.8，培养2011，得到芽孢生成率90%以上，活菌数为2.46\101°(^11/1111的地衣芽孢杆菌 发酵液； 所述的发酵培养基为：葡萄糖1. 5%，大豆蛋白胨1. 5%，豆柏1. 5%，硫酸铵0. 75%，氯 化钠0.6%，硫酸镁0.05% ;pH自然。
[0049] 5)地衣芽孢杆菌菌粉的制备：在步骤4)制备的发酵液中加入25%的填充物米 糠，混匀，进行喷雾干燥，进风温度120°C，排风温度40°C，雾化器转速16000rpm，得到水分 含量小于5%，活菌数大于lO^fu/ml的地衣芽孢杆菌菌粉。
[0050] 实施例5复合微生态制剂的制备 表9复合微生态制剂的制备
实施例6仔猪专用型复合微生态制剂对仔猪的功效试验 试验材料：断奶仔猪(漳州长泰晋祥和猪场);实施例5制取的仔猪