水疱性口炎病毒的改性基质蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明总体上设及生物技术和免疫学。具体地，本发明设及水瘤性口炎病毒(VSV) 的改性基质(^0蛋白、表达该改性M蛋白的减毒的重组体vsv和vsv基初免-加强免疫苗，该初 免-加强免疫苗诱导持久的体液、细胞介导和粘膜免疫应答，对抗携带外源基因的重组体 VSV所表达的外源抗原。
【背景技术】
[000引水瘤性口炎病毒(VSV)是负链RNA病毒，其感染大多数哺乳动物细胞，且在受感染 的细胞中表达高达全部蛋白质的60%的病毒蛋白[Kim, G. N.，and C. Y. Kang. Virology 357:41，2007]。实质上，VSV感染猪、牛和马，并且在口和足周围引发水瘤性疾 病。虽然已经报导了由VSV引起的人感染，但是VSV在人体内没有引起任何严重的症状 [Fields, B. N., and K. Hawkins. N E；ngl J Med 277:989, 1967; Johnson, K. M. et al. Am J Trop Med Hy邑 15:244， 1966]。
[0003] VSV编码五种蛋白，核衣壳(nucleocapsid)蛋白（N)、憐蛋白（P)、基质蛋白（M)、表 面糖蛋白（G)和RNA依赖性RNA聚合酶化）dVSV的N、P和L蛋白是合成正义和负义基因组RNA和 mRNA所需要的，其对合成VSV蛋白是必要的。
[0004] 通过VSV基质(M)蛋白阻断宿主细胞蛋白质合成诱导了细胞死亡。将水瘤性口炎病 毒印第安纳血清型(VSVind)中Μ蛋白在位点51的蛋氨酸残基变成精氨酸(M51R)，并且将水瘤 性口炎病毒新泽西血清型(VSVnj)M基因中在位点48(Met48)和51(Met51)的蛋氨酸变成精氨 酸(A;rg)，能够使VSV Μ蛋白的运种功能无效化im, G. and Kang, C, Virology, 357:41- 53, 2007)。尽管在Μ蛋白质中有运些Met向Arg突变的VSV已经显著地减少了细胞病变效应， 但是他们依然在细胞和受感染的动物中复制并产生子代病毒。VSVind奥尔赛(Orsay)菌株的 一种溫度敏感的（ts)M基因突变体，ts023已经在小鼠胶质细胞系在37°C和39°C显示了有限 的复制（Rabinowitz, S. et al. Infection and Immunity 33:120-125, 1981)。已经证 实，ts023的溫度敏感性是在39°C具有特征性子弹状结构的病毒装配启动不当或缺乏的结 果（Flood, E. et al. Virology 278:520-533, 2000; Lyles, D. et al. Virology, 217:76-87，1996)。此外，即便在直接接种到大脑中后，ts023在小鼠内也失去它的神经毒 性(Rabinowitz, S, et al. Infection and Immunity, 33:120-125, 1981)。
[000引在VSV奥尔赛菌株的野生型M和ts023的M之间有Ξ个氨基酸差异，运些差异是在第 21个氨基酸的甘氨酸(G)对谷氨酸(EKG2化），在第111个氨基酸的亮氨酸(L)对苯丙氨酸 (巧化111F)，W及在第227个氨基酸的组氨酸(H)对酪氨酸(Y)(H227Y)(Morita，K. et al. J. Virol. 61:256-263，1987)。回复突变体(revertant)中在Fill的单一氨基酸回复突变 成L表明Fill看来像是在ts023的溫度敏感性方面起到了主要作用。然而，其它两种突变可 能也有一些作用，因为在第111位点由F向L的单一突变没有完全地使病毒恢复到其野生型 显型（Morita, K. et al. J. Virol. 61:256-263，1987; Li, Y. et al. J. Virol. 62:3729-3737, 1988)0
[0006] 考虑到回复突变体中在Fill的单一氨基酸回复突变成L，其可能有利于引起既对 回复突变较不敏感又在ts023的溫度敏感性方面起作用的突变。
[0007] 目前，研究组已经开发出能复制的、装配缺陷的VSV作为更安全的疫苗载体，该VSV 缺失了G糖蛋白化)基因（Δ口或缺失了G和Μ基因两者（AMGXK址η, J. et al. J. Virol. 75:11079-11087，2001; Schwartz, J. et al.，Virology 366:166-73，2007)。然而，已 缺失了G基因，或缺失了Μ和G基因，VSV载体需要G或Μ和G两者反式蛋白（proteins in 化ans)的供应W生产装配缺陷的VSV。为了降低生产疫苗的成本，有必要生成运样的系统， 其能够生产能W高滴度(titer)复制的病毒疫苗载体。因此，所需要的是运样的VSV载体系 统，其可W是已经失去了它的毒性(无毒性的），并且在31°C仍然能够在体外复制到高滴度 的全长VSV载体，在非容许性溫度下不能适当地装配，诱导良好的对抗其表达的关注的基因 的免疫应答，并且具有较少机会回复到到野生型显型。
[0008] 本发明的进一步的和其它的目的将由W下的
【发明内容】
、发明的讨论及其实施方案 和实施例实现。
【发明内容】
[0009] 发明人已经生成了新的水瘤性口炎病毒(VSV)的基质(M)蛋白突变体，其包括VSV 印第安纳血清型(VSVind)和VSV新泽西血清型(VSVnj)。运些具有突变体Μ蛋白的新的VSV基本 上是非胞溶性的的、显著地减毒的和无毒性的的，包括神经毒性(更安全的）。此外，运些新 的具有突变体Μ蛋白的VSV能够诱导对抗关注的抗原或抗原决定部位（邱itope)的免疫应 答。该免疫应答可W是体液、细胞和粘膜免疫应答。此外，具有Μ突变体的VSVind在31°C能够 装配且通常地能够从受感染的细胞释放出来，但他们不能在37°C或更高溫度下适当地装 配，且相对于野生型VSVind，病毒从受感染的细胞的释放显著地减少了。此外，相对于现有技 术已知的Μ蛋白突变体，本发明的Μ蛋白突变体对回复突变可能较不敏感。
[0010] 照此，在一个实施方案中，本申请设及一种水瘤性口炎病毒(VSV)的改性基质(Μ) 蛋白。在一个实施方案中，本发明的改性Μ蛋白包括选自（i )和（i i )的氨基酸序列：（i )包括 至少W下置换:G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3;及（ii)包括至少W下置换:G2沈/M48R/ M51R的沈QID NO: 8。在本发明的一方面，SEQ ID NO: 8包括至少W下置换:G22E/L110A/ M48R/M51R。
[0011] 在本发明的一个实施方案中，（i)的改性Μ蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 4,且
[11] 的改性Μ蛋白包括氨基酸序列沈Q ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，（i)中在位点21的E和（ii)中在位点22的E由gaa密码 子编码，且其中（i )和（i i )中在位点51的R及（i i )中在位点48的R由cga密码子编码。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO: 4的在位点111的A和SEQ ID NO: 10的 在位点110的A由gca密码子编码。
[0014] 在本发明的一个实施方案中，（i)的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 2的基因编码， 且（ii)的氨基酸序列由包含沈Q ID NO: 6或沈Q ID NO: 7的基因编码。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种编码水瘤性口炎病毒(VSV)的改性的基 质00蛋白的核巧酸序列或基因，其中该核巧酸序列或基因包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和沈Q ID NO: 7的核巧酸序列。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组体VSV(rVSV)。本发明的rVSV，在一 个实施方案中，包括核巧酸序列或基因，该核巧酸序列或基因包含选自SEQ ID NO: 2、6和7 的核巧酸序列。
[0017] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组体水瘤性口炎病毒(rVSV)。根据前 面实施方案中的任一个，本发明的rVSV包括改性基质(M)蛋白。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，rVSV是重组体水瘤性口炎病毒印第安纳血清型 (rVSVind)，且改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包含至少W下置 换:G21E/L111A/M51R。
[0019] 在本发明的另一个实施方案中，rVSVind的改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 4的氨基酸 序列。
[0020] 在本发明的另一个实施方案中，rVSVind的改性Μ蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核巧 酸序列的基因编码。
[0021] 在本发明的另一个实施方案中，rVSVind在容许性溫度下能够产生VSVind颗粒，且在 非容许性溫度下不能产生该颗粒。
[0022] 在本发明的另一个实施方案中，rVSV是重组体水瘤性口炎病毒新泽西血清型 (rVSVNj)，且改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少W下置换： G22E/M48R/M51R。在本实施方案的一个方面，SEQ ID NO: 8包括至少W下置换：G22E/ L110A/M48R/M51R。
[002引在一个实施方案中，rVSVNj的改性Μ蛋白由包括SEQ ID NO: 6或沈Q ID NO: 7的核 巧酸序列的基因编码。在一个实施方案中，rVSVNj的改性Μ蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。
[0024] 在本发明的另一个实施方案中，rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，该病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原 体。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明的rVSV基本上是非胞溶性的和无毒性的。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗。该疫苗，在一个实施方案中，包括有 效量的改性的基质诚)蛋白，该改性Μ蛋白由核巧酸序列编码，该核巧酸序列包含选自下面 的序列：SEQ ID NO: 2、沈Q ID NO: 6和沈Q ID NO: 7。
[0028] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗。该疫苗，在一个实施方案中，包括 有效量的一种或多种减毒的重组体水瘤性口炎病毒(rVSV)，该一种或多种减毒的rVSV包括 改性基质诚)蛋白，该改性Μ蛋白包含选自（i)和(ii)的氨基酸序列：（0包括至少W下置换： G21E/L111A/M51R的沈Q ID NO: 3,及（ii)包括至少W下置换：G22E/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。在一方面，SEQ ID NO: 8进一步包括置换L110A。
[0029] 在本发明的疫苗的一个实施方案中，rVSV是重组体水瘤性口炎病毒印第安纳血清 型(rVSVind)，且改性Μ蛋白包括沈Q ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少W下置 换:G21E/L111A/M51R。
[0030] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSV是重组体水瘤性口炎病毒印第安纳血 清型(rVSVind)，且改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
[0031] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，改性Μ蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核巧酸 序列的基因编码。
[0032] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSVind在容许性溫度下能够产生rVSVind颗 粒，且在非容许性溫度下不能产生该颗粒。
[0033] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSVind是全长rVSVind。
[0034] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSV是重组体水瘤性口炎病毒新泽西血清 型(rVSVNj)，且改性Μ蛋白包含沈Q ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少W下置 换:G22E/M48R/M51R。在本实施方案的一个方面，SEQ ID NO: 8进一步包括置换L110A。
[0035] 在本发明的疫苗的一个实施方案中，rVSV是重组体水瘤性口炎病毒新泽西血清型 (rVSVNj)，且其中该改性Μ蛋白包含氨基酸序列沈Q ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。
[0036] 在本发明的疫苗的一个实施方案中，改性Μ蛋白由具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的核巧酸序列的基因编码。
[0037] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSVNj是全长rVSVNj。
[0038] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的 蛋白，且其中所述嵌合体rVSV能够诱导对所述蛋白的免疫应答。
[0039] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，疫苗包含减毒的嵌合体rVSV的混合物，其 中该混合物中至少两种嵌合体rVSV表达外源病原体的不同蛋白。
[0040] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性 病原体。
[0041] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，病原体是慢病毒。
[0042] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，慢病毒是HIV，且该外源病原体的蛋白是 HIV蛋白。
[0043] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，该病原体是HCV，且该外源病原体的蛋白是 HCV蛋白。
[0044] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，（i)中在位点21的E和在位点22的E由gaa密 码子编码，且在位点51的R和在位点48的R由cga密码子编码。
[0045] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，在位点111的A和在位点110的A由gca密码 子编码。
[0046] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，疫苗能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
[0047] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，疫苗进一步包含佐剂。
[0048] 在一个实施方案中，本发明提供了一种初免-加强免组合疫苗（prime boost combination vaccine)。该初免-加强免组合疫苗，根据一个实施方案，包括：（a)有效量的 包含一种血清型的减毒的重组体水瘤性口炎病毒(rVSV)的疫苗，该种血清型的减毒的rVSV 具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的第一种改性Μ蛋白；及(b)有效量的包含另一种血清 型的rVSV的疫苗，该种血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二种改性Μ蛋白。
[0049] 在初免-加强免组合疫苗的一个实施方案中，SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2 的基因编码。
[0050] 在初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因编码，且沈Q ID NO: 10由包含沈Q ID NO: 7的基因编码。
[0051] 在初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，（a)是初免疫苗（priming vaccine)，且（b)是加强免疫苗（booster vaccine)。
[0052] 在初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，（b)是初免疫苗，且(a)是加强免疫 苗。
[0053] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，两种减毒的rVSV是嵌合 体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中两种嵌合体rVSV能够诱导对该蛋白的免疫应答。
[0054] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，病原体是病毒性、真菌 性、细菌性或寄生性病原体。
[0055] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，病原体是慢病毒。
[0056] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，慢病毒是HIV，且蛋白是 HIV蛋白。
[0057] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，一种血清型的rVSV和另 一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白化)基因和RNA依赖性RNA聚合酶化)基因，且其中用于表 达HIV蛋白的基因插入在G基因和L基因之间。
[0058] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，其中HIV基因选自由env、 gag和pol组成的HIV基因组。
[0059] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，病原体是HCV，且抗原决 定部位是HCV蛋白。
[0060] 在本发明的初-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，一种血清型的rVSV和另一 种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依赖性RNA聚合酶化)基因，且用于表达HCV 蛋白的基因插入在G基因和L基因之间。
[0061] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，HCV蛋白是结构性或非结 构性HCV蛋白。
[0062] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，运两种疫苗中的每一种 包括减毒的嵌合体rVSV的混合物，且在混合物中至少两种减毒的嵌合体rVSV具有病原体的 不同蛋白。
[0063] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，两种疫苗的每一种能够 诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
[0064] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，疫苗(a)的rVSV的血清型 是印第安纳，且疫苗(b)的rVSV的血清型是新泽西。
[0065] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，疫苗(a)和疫苗(b)的每 一种进一步包含佐剂。
[0066] 根据另一个实施方案，本发明提供了一种试剂盒。该试剂盒，在一个实施方案中， 包括：（a)至少一剂有效量的疫苗，其包含重组体水瘤性口炎病毒印第安纳血清型 (rVSVind)，rVSVind具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的改性Μ蛋白，及(b)至少一剂有效 量的疫苗，其包含重组体水瘤性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNj)，rVSVNj具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的改性Μ蛋白。
[0067] 在本发明的试剂盒的一个实施方案中，（a)和(b)是在药物可接受的载体中配制。 [006引在本发明的试剂盒的在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的 基因编码。
[0069] 在本发明的试剂盒的在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的 基因编码，且沈Q ID NO: 10由包含沈Q ID NO: 7的基因编码。
[0070] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的肤，其包含选自列为SEQ ID NO: 4、9和10的氨基酸序列组的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的肤是W纯化的形式提 供。
[0071] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核巧酸序列，其包含选自组SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7的核巧酸序列。在一个实施方案中，分离的核巧酸 序列是W纯化的形式提供。
[0072] 在一个实施方案中，本发明提供了本发明的疫苗用于在受试主体(subject)内诱 导免疫应答。
[0073] 在一个实施方案中，本发明设及本发明的初免-加强免组合疫苗用于在受试主体 内诱导免疫应答。
[0074] 在另一个实施方案中，本发明设及一种在受试主体内诱导免疫应答的方法。该方 法，根据一个实施方案，包括对受