针对神经胶质瘤细胞的适体的制作方法
【专利说明】针对神经胶质瘤细胞的适体
[0001] 本发明设及适体、适体的配体结合片段W及寡核巧酸。本发明还设及运些剂在预 防和/或治疗癌症W及诊断癌症中的用途。公开的剂及方法特别地可用于脑癌诸如神经胶 质瘤。
[0002] 引言
[0003] 在2010年，仅在UK就有9,156例脑癌新病例(Cancer Research UK)。在世界范围， 估计每年有445,000例脑癌新病例（Cancer Research UK)。对于被诊断为患有GBM(W册IV 级）的患者，观察到平均少于5%的幸存者的预后超过5年（Ohgaki和Kleihues，2005; Schwartzbaum等人，2006)。由于人口逐年增长，所W脑癌的发生率将随之增长，突显出对改 进的诊断、预后和响应于治疗的预测的需求。在UKW及世界范围内，本发明均具有满足运一 需求的潜力。
[0004] 脑肿瘤手术的目的是最大程度去除肿瘤组织并使对周围正常脑组织W及血管结 构的附带损伤Collateral damage)最小化(Thoman等人，2006)。几项研究已经证明目前的 疗法受限于无效的早期诊断、药物浓度不足W到达肿瘤、药物毒性W及不良的治疗监控化i 等人，2009; Jiang等人，2010;Esposito等人，2011)。对于科学研究者(包括制药产业)来说， 发现能够仅杀死癌细胞同时不伤害正常细胞的药物一直是个挑战。用于癌症的祀向药物递 送需要运样的自动引导装置化oming device):由于自动引导装置的受体的过表达，所述自 动引导装置可将药物特异性地运载至癌细胞。分子祀向已是神经胶质瘤的诊断和治疗中的 新颖的方法之一。该方法基于鉴定可表达独特受体或抗原的神经胶质瘤癌细胞群体，所述 独特受体或抗原被用作祀向分子用于治疗目的(C化iel等人，2011 ;Meyer等人，2011)。
[0005] 很多生物递送系统已被选择性地用于使用在文献中受到重点关注的适体和单克 隆抗体将成像探针祀向肿瘤细胞化ei 1 ig，2004; Shangguan等人，2008;Cibiel等人，2011)。 由于小且高度结构化的单链DNA或RNA分子的适体的高度限定的Ξ维结构，所述Ξ维结构有 助于所述适体W纳摩尔级亲和力和高特异性与其祀向的分子W高亲和力结合，所W本项目 将使用小且高度结构化的单链DNA或RNA分子的所述适体作为理想的祀向剂(Cerchia等人， 2009 ;Bayrac 等人，2011)。
[0006] 根据本发明的第一方面，提供了适体或该适体的配体结合片段，所述适体包含选 自由 W下组成的组的核酸序列：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、沈 Q ID N0:3、SEQ ID N0:6、 沈9 10備：7、569 10備：8、569 10備：9、569 10備：10和沈9 10備：11。
[0007] 根据本发明的第一方面的适体基于其结合与癌细胞相关的配体的能力来选择。该 结合特性意味着本发明的适体在很多应用中具有效用，所述应用包括但不限于:治疗用途、 诊断用途和研究用途。关于运些用途的更多细节在本公开内容的别处列出。
[000引如由SEQ IDN0:2的适体所示例的，本发明的适体显示出能够跨越血脑屏障的出乎 意料且有益的特性。该特性是有优势的原因在于血脑屏障否则可对被施用至身体、能够到 达大脑内存在癌症诸如神经胶质瘤的部位的剂(诸如治疗剂或成像剂)构成重要障碍。出乎 意料的是先前公布的结果已表明为了使适体跨越血脑屏障，必须将它们与祀向部分缀合。 本发明的适体跨越血脑屏障而不需要添加此类祀向部分的能力因此是预料不到的优势。
[0009] 将领会到有可能能够对本发明的第一方面的适体或其配体结合片段做出一些改 变，而不丢失运些适体和片段的基本功能。因此，本发明还提供了寡核巧酸，所述寡核巧酸 与沈Q ID NO: 1至3或6至11中的任一个共有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性，其中所述寡核巧酸保留了 与所讨论的适体相同的结合特性。为了简洁的目的，并且除了上下文另外需要处之外，在本 公开内容中提及"本发明的适体"还应该被认为包括基于此类适体的寡核巧酸。
[0010] 本发明的寡核巧酸的结合特性和本发明的适体的片段的配体结合性质可例如，使 用在实验结果部分描述的方法诸如流式细胞技术被容易地确定。对于本发明的第一方面的 寡核巧酸或适体片段的结合特性和配体结合藉W可在实验上被确立的其他合适技术对于 本领域技术人员将是明显的。
[0011] 不偏离W上所考虑的，对于基于本文公开的适体序列的变体，在合适的实施方案 中，本发明的第一方面的适体可由选自由W下组成的组的核酸序列组成:沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、沈Q ID N0:3、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10和沈Q ID NO: 11。
[0012] 本发明的适体或其配体结合片段结合与癌细胞相关的配体的能力使运些剂高度 适用于治疗性应用。技术人员将领会到本发明的适体结合与癌细胞相关的配体的能力使运 些适体非常适用于其中希望使抗癌剂祀向肿瘤的治疗性应用。
[0013] 仅通过举例的方式，已经设计出许多运样的治疗策略，其中与癌细胞的要素(例如 在此类癌细胞的表面上表达的标志物)结合的剂被用于祀向递送治疗性有效负载。将领会 到本发明的适体良好适用于如此使用。
[0014] 此类实施方案可治疗性地使用与抗癌剂缔合的本发明的适体或其配体结合片段。 适体和抗癌剂可经由任何合适的方式彼此缔合。适体和抗癌剂可直接或间接地彼此缔合。 在该上下文中，就"间接地缔合"而言意指适体与载体缔合，且抗癌剂与载体而不是直接与 适体本身缔合。
[0015] 仅通过举例的方式，在一个合适的实施方案中，适体和抗癌剂可彼此缀合。在合适 的实施方案中，抗癌剂可由合适的载体包封，或附接(例如共价地或非共价地)至合适的载 体。在此类实施方案中，合适的载体的实例可选自由W下组成的组:纳米颗粒(诸如纳米壳） 和树枝状聚合物。合适地，纳米颗粒可包封抗癌剂或由抗癌剂包被。树枝状聚合物也可包封 抗癌剂、或可使抗癌剂附接至树枝状聚合物的外周基团。
[0016] 抗癌剂可W是本领域技术人员已知的期望被祀向癌细胞部位，诸如肿瘤的任何此 类剂。仅作为非限制性示例，在合适的实施方案中，抗癌剂可选自由W下组成的组:放射性 核素；纳米颗粒，诸如纳米壳;纳米笼;基因沉默剂;和细胞毒性化合物。在合适的实施方案 中，可将本发明的适体与运些抗癌剂的任一个或任何组合缔合。
[0017] 放射性核素和细胞毒性化合物可具有杀死被祀向的癌细胞的固有能力，而纳米颗 粒(诸如纳米壳)或纳米笼当被照射时能够吸收能量，W使得其溫度增加，允许它们杀死被 祀向的癌细胞-该技术有时被称为光动力疗法。光动力疗法还可利用近红外染料，当被照射 时，所述近红外染料降解W释放能够杀死附近细胞的活性氧(reactive 0巧gen species)。 将领会到运类染料还构成了可与根据本发明的适体缔合的抗癌剂。
[0018] 基因沉默剂能够通过干扰转录或翻译来阻止或抑制基因表达的过程。取决于待沉 默的基因的性质，基因沉默剂可具有固有的抗癌活性或可适合于被用作其他抗癌疗法的辅 助物。
[0019] 基因沉默剂的合适的实例可选自由W下组成的组:siRNA分子、核酶和反义寡核巧 酸。待沉默的基因可参考所选择的本发明的适体(与基因沉默剂缔合的）与之结合的细胞的 已知特性来选择。例如，待沉默的基因可W是编码适体与之结合的配体的基因。
[0020] 如在本公开内容中别处讨论的，发明人已鉴定了由SEQ ID NO: 2(也被称为SA43或 GL43)组成的本发明的适体，SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3与Ku异二聚体中的配体化u70或 Ku80)结合。不希望被任何假设所束缚，发明人认为被运些适体结合的配体最有可能是 Ku70〇
[0021] 技术人员将领会到Ku异二聚体的生物学功能在于DM修复，并因此该适体将特别 地非常适合祀向已被暴露于福射或DNA损伤剂的癌细胞。
[0022] 此外，认识到本发明的适体能够与Ku异二聚体内的配体结合可使此类适体令人注 目地用于基因沉默剂的祀向。仅通过举例的方式，当包含SEQ ID N0:l、2或3的本发明的适 体(或其配体结合片段）与针对Ku70和/或Ku80的基因沉默剂缔合时，此类适体可与其他抗 癌疗法组合使用，在所述其他抗癌疗法中使用放射性或其他DNA损伤方法杀死癌细胞。本发 明的适体有效地祀向表达Ku异二聚体的癌细胞，并然后阻止或抑制表达(并且因此抑制该 异二聚体的功能）的能力将减少DNA修复，并因此增加基于DNA损伤的疗法的效果。
[0023] 因此，可期望包含SEQ ID NO: 1、2或3的适体或此类适体的配体结合片段包含阻止 或抑制Ku70和/或Ku80的基因表达的基因沉默剂。合适的基因沉默