一种玉米微生物耐药性基因的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种玉米微生物耐药性基因的检测方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素类药物广泛应用于防治玉米病害，目前玉米病害在防治过程中，滥用抗生 素类药物现象十分普遍，导致病原微生物进化出耐药性基因，产生耐药性，使得抗生素类药 物在防治玉米病害时失效。因此，需要针对玉米中微生物耐药性基因针对性地用药，W避免 病原菌产生耐药性，同时，减少农药用量，降低成本。
[0003] 现有的检测耐药性基因的方法包括:预估待测样品上携带的需要检测的耐药性基 因的病原菌，分离并纯化该病原菌，通过PCR(Polymease化ain Reaction,聚合酶链式反 应）引物扩增该耐药性基因，利用电泳或实时定量PCR方法逐一判断待测样品中是否存在需 要检测的耐药性基因。
[0004] 在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在W下问题中的一种：
[0005] 需要培养、分离和纯化病原菌，使得检测的时间较长，延误治疗时机;无法检测不 可培养的耐药菌中的耐药性基因；一次只能针对一种或少数几种病原菌进行检测；一次只 能检测一种或少数几种耐药性基因，不能检测到待测样品中所有的耐药性基因，不能给予 用药所需的全面信息;不能实现耐药性基因的定量检测。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中检测耐药性基因的方法有待提高的问题，本发明实施例提供 了一种玉米微生物耐药性基因的检测方法。所述技术方案如下：
[0007] 本发明实施例提供了一种玉米微生物耐药性基因的检测方法，所述方法包括：
[000引确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源标准基 因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为整株玉米植株或部分所述玉米植株；
[0009] 制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区 域的多重扩增引物；
[0010] 提取所述待测样品的基因组；
[0011] 向所述待测样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；
[0012] 利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增 产物构建高通量测序文库；
[0013] 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；
[0014] 分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的数量、 所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；
[0015] 根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数 量，判断实验是否成功；
[0016] 若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量；
[0017] 根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因。
[0018] 具体地，所述耐药性基因至少为1个，所述内源标准基因至少为1个，所述外源标准 基因至少为1个。
[0019] 具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的微生物中的基因。
[0020] 具体地，所述外源标准基因不存在于已知基因组的生物中。
[0021] 具体地，用于扩增所述耐药性基因的引物的设计区域或扩增区域与所述待测样品 中的生物的基因组的其它区域的所有生物的基因组上除耐药性基因外的其它区域的同源 性低于98%。
[0022] 具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数 量和所述内源标准基因的测序片段的数量均含α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的 测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败;其中，α1为判 定阔值。
[0023] 具体地，计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量的方法为:第m种所述耐药性 基因的含量的计算公式为
廷中，i为第m种所述耐药性基因的第i 个测试区域，nl为所述第m种所述耐药性基因的测试区域的个数，bi为所述第m种耐药性基 因的第i个测试区域的测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基 因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种所述内源标准基因的 测试区域的个数，aj为第k种所述内源标准基因的第巧巾测试区域的测序片段的数量;N为所 有所述内源标准基因的测试区域的总数。
[0024] 具体地，判定所述待测样品中是否含有所述耐药性基因的方法为:所述耐药性基 因的含量含02时，判定所述待测样品含有所述耐药性基因；当所有所述耐药性基因的含量< 口 2时，判定所述待测样品不含有所述耐药性基因；其中，α2为判定阔值。
[0025] 具体地，所述方法还包括：向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的 外源核酸，将所述外源核酸与所述待测样品的基因组一同提取。
[0026] 具体地，所述外源标准基因的质量与所述待测样品的基因组的总质量的比例大于 1/100000。
[0027] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明实施例提供的方法可W 在不需要培养与纯化的前提下，一次性的、定量的、快速的、准确的检测任意数量和类型的 微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因，可W给予用药所需的全面信息。
【具体实施方式】
[0028] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。
[0029] 实施例
[0030] 玉米微生物的耐药性基因检测
[0031] 待测样品可W为整株玉米植株或部分玉米植株，本实施例中待测样品为玉米叶 片，本实施例中使用的玉米叶片取自武汉浊口开发区的玉米田，检测其中的微生物的耐药 性基因是为了针对性地对玉米病害用药，避免耐药性的产生，同时，减少不必要的用药，节 约成本。本实施例包括如下步骤：
[0032] 步骤1、确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、待测样品中的内源标准 基因和待测样品的外源标准基因，具体方法如下：
[0033] 其中，耐药性基因至少为1个，内源标准基因至少为1个，外源标准基因至少为1个。 内源标准基因为待测样品的微生物中的基因。外源标准基因不存在于已知基因组的生物 中。
[0034] 本实施例中的耐药性基因抗青霉素、β-内酷胺酶、头抱菌素酶、卡那霉素和新霉 素，其中，耐药性基因 APH(3'）-Ia同时抗卡那霉素和新霉素。本实施例中内源标准基因为1 种，具体地，内源标准基因为核糖体rRNA基因，该核糖体rRNA基因存在于绝大部分生物中且 具有保守区域。在本实施例中，外源标准基因为巧巾，具体地，外源标准基因为邸CC-00004基 因，其在NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih.gov)上进行同源比对时，未发现其在已知生物参 考基因组中存在同源序列，即外源标准基因不存在于已知的生物基因组中。表1为本实施例 中被检测基因相关信息与检测结果，在表1中耐药性基因名称与序列编号与抗生素耐药性 数据库（CRAD:The Comprehensive Antibiotic Resistance Datab ase，网址为 a巧card.mcmaster. ca/)中的名称与序列编号一致。
[0035] 表1为本实施例中被检测基因相关信息与检测结果
[0036]
[0037]
[003引表1中'7'表示无。
[0039] 步骤2、制备用于扩增耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因的测试区域的多 重扩增引物，具体方法如下：
[0040] 选择耐药性基因的保守区域设计多重扩增引物；用于扩增耐药性基因的引物的设 计区域或扩增区域与待测样品中的生物的基因组的其它区域的同源性低于98%，运一要求 确保了耐药性基因的检测不受待测样品中的生物的基因组的其它区域的干扰。具体地，耐 药性基因的引物的设计区域在不同变体间是保守的，运样才能保证用相同的引物可W扩增 出相同的耐药性基因的不同变体，若耐药性基因的引物的设计区域与待测样品中的生物的 基因组的其它区域的同源性低于98%，则该引物不会扩增其它区域，因此，不会干扰耐药性 基因的检测。否则，要求耐药性基因的引物的扩增区域与待测样品中的生物的基因组的其 它区域的同源性低于98%，运样，获得的扩增产物可W与耐药性基因相区分，同样不会干扰 耐药性基因的检测。同时，多重扩增引物中每对引物的扩增效率均在95%~105%之间。
[0041] 具体地，在抗生素耐药性数据库中下载表