盐酸可卡因的药物组合物及其在生物医药中的应用
【专利摘要】本发明公开了盐酸可卡因的药物组合物及其在生物医药中的应用，本发明提供的盐酸可卡因的药物组合物中含有盐酸可卡因和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，盐酸可卡因、化合物(Ⅰ)单独作用时，可以降低短暂脑缺血再灌注引起的损伤；盐酸可卡因和化合物(Ⅰ)联合作用时，治疗作用进一步提高，可以开发成治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
盐酸可卡因的药物组合物及其在生物医药中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及盐酸可卡因的新用途，具体涉及盐酸可卡因的药 物组合物及其在生物医药中的应用。
【背景技术】
[0002] 盐酸可卡因是可卡因的盐酸盐，具有广泛的药理作用。
[0003] 迄今为止，尚未见盐酸可卡因及其药物组合物与短暂脑缺血再灌注损伤的相关性 报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种盐酸可卡因的药物组合物，该药物组合物中含有盐酸 可卡因和一种结构新颖的天然产物，盐酸可卡因和该天然产物可以协同治疗短暂脑缺血再 灌注损伤。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 一种具有下述结构式的化合物a)，
[0007]
[0008] -种盐酸可卡因的药物组合物，包括盐酸可卡因、如权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0009] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0010] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0011] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将枇杷叶粉碎，用65~75%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇取物用 大孔树脂除杂，先用20 %乙醇洗脱9个柱体积，再用65 %乙醇洗脱10个柱体积，收集65 %洗 脱液，减压浓缩得65%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中65%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分 离，依次用体积比为65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步 骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1、7:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为58 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集11~15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到 化合物(I)。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为DlOl型大孔吸附树脂。
[0013] 上述化合物(I)在制备治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。
[0014] 上述盐酸可卡因的药物组合物在制备治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物中的应 用。
[0015] 本发明的优点:本发明提供的盐酸可卡因的药物组合物中含有盐酸可卡因和一种 结构新颖的天然产物，盐酸可卡因和该天然产物单独作用时，对短暂脑缺血再灌注损伤具 有治疗作用;二者联合作用时，对短暂脑缺血再灌注损伤的治疗效果进一步提高，可以开发 成治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。
[0017] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0018]分离方法：（a)将枇杷叶（2kg)粉碎，用70%乙醇热回流提取（15LX 3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水饱和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用DlOl型大孔树脂除杂，先用20%乙醇洗脱9个柱体积，再用65%乙醇洗脱 10个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩得65%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中65%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1 (9个柱体积）、35:1 (10个柱体积）、15:1 (8 个柱体积)和7:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4 用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1(6个柱体积）、7:1(7个柱体积)和1:1(6个柱 体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为58 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集11~15个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0019] 结构确证：白色无定形粉末;HR-ESI-MS显示[Μ+Na]+为m/z 399.2116,结合核磁特 征可得分子式为C22H32O5，不饱和度为7。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρηι，DMS0_d6，400MHz): H-I (2.71，t，J = 9.6)，H-2(1.68，ddd，J=14.4,9.6,3.0)，H-2(2.24，ddd，J=14.4,9.6,6.9)， H-3(3.54，dd，J = 6.9,3.0)，H-6(2.28，dd，J=10.3，1.9)，H-7(1.57，m)，H-7(1.86，m)，H-9 (2.55，dd，J=9.0,8.1)，H-ll(1.32，m)，H-ll(1.54，m)，H-12(1.52，m)，H-12(1.86，m)，H-13 (2.44，dd，J = 6.1，2·3)，H-14(4.07，s)，H-15(1.86，m)，H-15(2.37，d，J=14.4)，H-17 (1.56，s)，H-18(1.01，s)，H-19(l.ll，s)，H-20(4.87，s)，H-20(4.96，s)，16-0Ac(1.91，s); 核磁共振碳谱数据6。（？?111，015〇-(16，1001!^) :44.1(01，1-〇,39.2(012,2-〇,82.2(01，3-C)，51.0(C，4-C)，75.8(C，5-C)，52.6(CH，6-C)，39.4(CH2,7-C)，48.9(C，8-C)，55.4(CH，9-C)，151.3(C，10-C)，24·1(CH2，11-C)，24.2(CH 2，12-C)，51.7(CH，13-C)，78.8(CH，14-C)， 59.5(CH2，15-C)，91.9(C，16-C)，23.2(CH 3，17-C)，24.6(CH3，18-C)，19.1(CH3，19-C)，113.3 (CH 2，20-C)，173.1 (C，16-OAc)，22.6 (CH3，16-OAc)。红外光谱表明该化合物含有羟基 (3432cm-4和酯羰基（1716cm-4 D1H-NMR谱显示三个甲基（δΗΙ .01，1.11，1.56)，一个乙酰基 (δΗ1·91)，一个环外亚甲基信号（δΗ4·87和4.96)，以及三个含氧次甲基质子0!12.28,3.54 和4.07) </3C-NMR谱显示了 22个碳信号，包括六个季碳(两个含氧季碳SC75.8，91.9，一个烯 属季碳δ(：151.3, 一个酯羰基碳δ(：173.1)，六个次甲基（三个含氧次甲基δ〇52.6,78.8和 82.2)，六个亚甲基(一个烯属亚甲基δα?3.3)，以及四个甲基(一个甲氧基SC22.6)。两个含 氧碳信号（SC52.6和75.8)以及氢质子信号（δΗ2.28，dd，J = 10.3，1.9Hz)表明该化合物含有 一个 5,6-环氧基团。腿8(：谱中，!1-14与(：-7，(：-8，(：-9，(：-12，(：-13，(：-15和(：-16的相关性表明 C-14位连有一个羟基。NOESY谱中，乙酰质子、H2-15和H3-17之间显著的相关性表明C-16位连 有一个乙酰氧基。NOESY谱中，H 3-18、H-1和H-3的相关性，以及缺少H-I和H-9的相关性表明 H-I为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本 确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0020] 该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0021]
[0022] 实施例2:药理作用
[0023]本实施例采用阻断小鼠双侧颈总动脉lOmin，再灌注15min，造成小鼠短暂性脑缺 血再灌注模型，观察药物改善脑缺血状况和护脑作用的效果。
[0024] 1、材料与方法
[0025] 1.1动物
[0026] 昆明种小鼠，清洁级，雄性，体质量18~22g，河南省实验动物中心提供。
[0027] 1.2试剂与样品
[0028] 盐酸可卡因购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。 华佗再造丸，广州奇星药业有限公司；氯化钠注射液，郑州化学药业有限公司；水合氯醛，上 海山浦化工有限公司;ATP酶检测试剂盒、乳酸(LD)检测试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂 盒，南京建成生物工程研究所;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津市福晨化学试剂厂。
[0029] 1.3仪器
[0030] UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；TGL-16G台式离心机， 上海安亭科学仪器厂；电子分析天平，奥豪斯(上海）公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京 永光明医疗仪器厂;DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司。
[0031] 1.4小鼠分组及模型制备
[0032]取小鼠60只，随机取10只作为空白对照组，其余小鼠随机分均分为5组，采用阻断 小鼠双侧颈总动脉lOmin，再灌注15min，造短暂性脑缺血再灌注模型。造模型5组分为模型 对照组、阳性对照组(华佗再造丸2.67g/kg，用0.5 %CMC-Na配成0.134g/mL的混悬液）、盐酸 可卡因组（80mg · kg^1)、化合物（I)组（80mg · kg^1)、盐酸可卡因与化合物（I)组合物组 【40mg · kg^1盐酸可卡因+40mg · kg^1化合物（I)】。给药组给药容积为20mL/kg，灌胃给药，每 天给药1次，连续IOd。模型对照组和空白对照组均灌胃给药0.5 % CMC-Na，给药容积为20mL/ kg，每天给药1次，连续l〇d。
[0033] 1.5凝血时间和脑匀浆中LD含量的测定
[0034] 于第10天给药后Ih(禁食不禁水12h)，造模小鼠以4%水合氯醛lOmL/kg腹腔注射 麻醉(翻正反射消失），酒精消毒颈部，用手术刀作颈部正中切口，分离周围肌肉，见到双侧 颈总动脉(CCA)，再用弯头小镊子剥离周围神经，分离CCA，微动脉夹夹闭CCA阻断血管血流， IOmin后取下微动脉夹，再灌注15min，造成小鼠短暂性脑缺血再灌注模型；空白组仅作假手 术处理，只分离CCA，不阻断血流。再灌注15min后立即断头，用毛细血管法测定凝血时间。 [0035] 1 · 6小鼠脑匀衆ATP酶活力的测定
[0036] 再灌注15min后立即断头，立即在冰盘中分离脑，矢状切取，用滤纸吸干净附着的 血液，称重，以脑组织(g):生理盐水(mL) = 1:9的比例在盛有冰块的玻璃匀浆机中匀浆，制 备10 %脑勾衆，低温离心机3000r/min离心20min，取上清液于-20°C以下低温保存，测定Na +-K+-ATPase的活力（单位为ymoL · mg-1 · h-1) 〇
[0037] 1.7统计学方法
[0038] 用SPSS13.Ofor windows统计软件，计量资料以i±s表示，采用单因素方差分析， 然后用LSD检验进行两两比较。等级资料用Ridit分析。
[0039] 2、实验结果
[0040] 2.1对短暂性脑缺血再灌注模型小鼠凝血时间和脑匀浆中LD含量的影响
[0041] 与空白对照组比，模型对照组凝血时间显著缩短(P〈0.01)，脑匀浆LD含量升高(P〈 0.05);与模型对照组比，盐酸可卡因与化合物（I)组合物组和阳性对照组凝血时间显著延 长(P〈0.01)、脑匀浆LD含量显著降低(P〈0.01);与模型对照组比，盐酸可卡因组、化合物（I) 组凝血时间延长(P〈0.05)，脑匀浆LD含量降低(P〈0.05)。结果见表1。
[0042] 2.2对短暂性脑缺血再灌注模型小鼠脑匀衆ATP酶活力的影响
[0043]与空白对照组比，模型对照组小鼠脑匀浆中Na+-K+-ATPase活力显著降低（P〈 0.01)，说明脑细胞能量代谢障碍;与模型对照组比，盐酸可卡因与化合物（I)组合物组和阳 性对照组小鼠脑匀浆中Na+-K +-ATPase活力显著升高(P〈0.01);与模型对照组比，盐酸可卡 因组、化合物⑴组小鼠脑匀浆中Na +-K+-ATPase活力升高(P〈0.05)。结果见表1。
[0044]表1对短暂性脑缺血再灌注模型小鼠凝血时间和脑匀浆中LD含量、ATP酶活力的影 响
Luw&」 畎皿?生脑皿官炳定厄吾人关王偭与健屎HT吊'见炳，共令咼及炳準、咼规戏準、咼夕匕 亡率的特点，是由于脑部供血障碍引起脑组织相应区域缺血、低氧，造成脑组织损害所出现 的一系列生化代谢失常、生理功能丧失、病理形态改变等，是一种在脑组织上受到多层次、 多方面损害的疾病。临床表现主要是脑组织缺血，进而导致脑髓神经受损，出现半身不遂、 言语謇涩或不语、口舌歪斜、偏身麻木等临床症状，甚至出现神志障碍。当脑缺血发生时，脑 组织供血不足，能量合成物质供应缺乏，首先发生能量代谢障碍，糖无氧代谢产生LD增多， ATP耗竭，红细胞膜ATP酶活性下降，凝血活性增强，可导致微血管闭塞，血流阻力增大，继而 造成脑部微循环障碍，加重脑组织缺血缺氧。
[0047]上述结果表明，盐酸可卡因、化合物（I)单独作用时，可以降低短暂脑缺血再灌注 引起的损伤;盐酸可卡因和化合物（I)联合作用时，治疗作用进一步提高，可以开发成治疗 短暂脑缺血再灌注损伤的药物。
[0048]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物α)， *. ~.0.2. -种盐酸可卡因的药物组合物，其特征在于:包括盐酸可卡因、如权利要求1所述的 化合物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的盐酸可卡因的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载 体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载 体或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的盐酸可卡因的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、 胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射 剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将枇 杷叶粉碎，用65~75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用20%乙醇洗脱9个柱体积，再用65%乙醇洗脱 10个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩得65%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中65%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1、7:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为58 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集11~15个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。7. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。8. 权利要求2~4任一所述的盐酸可卡因的药物组合物在制备治疗短暂脑缺血再灌注 损伤的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/336GK105859656SQ201610380061
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】蒋灵锟
【申请人】蒋灵锟