一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及海洋生物技术领域，具体是一种不同分子量β?C?2,3,6?壳聚糖硫酸酯及其制备方法。不同分子量β?C?2，3，6?硫酸酯?壳聚糖，其结构式如下，其中n为聚合度：2～200；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3?)的含量为31.3％～36.5％。本发明制备方法属均相反应，简单易行，原料利用率高。
【专利说明】
_种不同分子量卜G_2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及海洋生物技术领域，具体是一种不同分子量0-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 甲壳素是世界第二大纤维素资源，由于来源不同，其构型可分为a-甲壳素、甲壳 素、y-甲壳素，目前研究最多的为甲壳素，为反平行结构，其次为甲壳素，为平行结构， 不同构型的甲壳素可能显示不同的功效。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得到的产物，其生物相 容性好，但由于其难溶于水和大部分有机溶剂而限制了其应用；天然制备的壳聚糖分子 量通常在2000kDa以上，因而粘度很大不方便应用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是要提供一种不同分子量e-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0005] -种不同分子量0-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯，不同分子量0-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚 糖，其结构式为：
[0007] 其中n为聚合度：2~200;化合物的活性基团--硫酸酯基（0S0〇的含量为 31.3%~36.5%。
[0008] 不同分子量0-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯的制备方法：
[0009] (1)磺化试剂的制备:将N，N-二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下 滴加氯磺酸，使其在〇_5°C磺化反应;其中N，N-二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5:1)-(1〇：1);
[0010] (2)不同分子量的壳聚糖的制备:将高分子量壳聚糖溶于过量的酸性溶液中， 而后再加入双氧水(使溶液中H 202最终体积分数为1-3 % )，混匀后于60-80 °C水浴搅拌10-60 分钟，得到不同分子量的壳聚糖；
[0011] (3)e-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的e-壳聚糖， 加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N，N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上 述磺化试剂，混合均匀后在微波辐射40_70°C条件下反应，反应后纯化得不同分子量的P-C-2,3,6_硫酸酯-壳聚糖；
[0012] 其中，壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N，N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.5: 20-25: (g:ml:ml); 壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1:15-25(g:ml)。
[0013] 所述高分子量e-壳聚糖的分子量为2000kDa-4573kDa。其，来源于鱿鱼软骨、墨鱼 软骨等材料。
[0014] 所述步骤2)酸性溶液为浓度为1-3 %甲酸、乙酸或盐酸。
[0015]所述步骤(3)将分子量低于lOKDa的壳聚糖原料，在40-45°C的微波辅助条件下反 应1-3分钟，得到1000-4000Da分子量的0-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯；
[0016]将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料，在45-55°C的微波辅助条件下反应1-5分钟， 得到4.5-10KDa的P-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯；
[0017]将分子量在lOOKDa以上的壳聚糖原料，在45-70 °C的微波辅助条件下反应1-5分 钟，得到l〇-l〇〇KDa的P-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯。
[0018] 所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积的无水乙醇，室 温沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的P-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的粗产品；将 上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，再用NaOH溶液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥 得不同分子量的0-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖纯品。
[0019] 本发明所具有的优点：
[0020] 本发明将粘度极大的壳聚糖最终反应生成不同分子量的壳聚糖硫酸酯类化 合物，是壳聚糖经磺化后所得2，3，6位壳聚糖硫酸酯衍生物，具有强聚阴离子性质。具体，本 发明用壳聚糖原料降解成分子量更小的0壳聚糖，方便制备成不同分子量的壳聚糖硫 酸酯，从而获得良好的水溶性，应用更加方便。同时本发明采用的壳聚糖硫酸酯类化合物的 含硫量高，对壳聚糖原料利用率高；制备过程采用均相反应，制备方法简单快速，操作成本 低，污染少。所用壳聚糖原料为不同分子量的壳聚糖，可得到不同分子量的壳聚糖硫酸 酯。且不同分子量的壳聚糖在许多活性方面如抑菌、促生长、免疫调节等方面显示不同的活 性，因而本发明制备了不同分子量的壳聚糖硫酸酯，从而改善其生物活性。本发明制备方 法属均相反应，简单易行，原料利用率高。
【附图说明】
[0021] 图1为壳聚糖原料的红外表征谱图。在1652CHT1附近，壳聚糖只有一个氨基峰， 而另一氨基峰则位于1558CHT 1附近，符合壳聚糖结构特征。
[0022]图2为分子量为3 169Da的P-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在 1215.33CHT1处出现了 S = 0的非对称伸缩振动，在809.04CHT1处出现了 C-0-S的对称伸缩振 动，证明了分子中硫酸酯基(-〇S(V)的存在。
[0023]图3为分子量为5030Da的P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在 1219.52CHT1处出现了S = 0的非对称伸缩振动，在811.99CHT1处出现了C-0-S的对称伸缩振 动，证明了分子中硫酸酯基(-〇S(V)的存在。
[0024]图4为分子量为1448 1 Da的P-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在 1213.41CHT1处出现了 S = 0的非对称伸缩振动，在810.16CHT1处出现了 C-0-S的对称伸缩振 动，证明了分子中硫酸酯基(-〇S(V)的存在。
[0025]图5为分子量为3169Da的P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。
[0026]图6为图5为分子量为5030Da的P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。
[0027]图7为分子量为14481Da的P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。
[0028]图8为分子量为5030Da的P-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振氢谱。可以看出在 壳聚糖的2,3,6位引入硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使氢的化学位移向低场漂 移。
[0029]图9为分子量为5030Da的P-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振碳谱。可以看出在 壳聚糖的2,3,6位引入硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用化学位移向低场漂移。
【具体实施方式】
[0030] 本发明的实施例结合附图进一步说明如下。
[0031] 实施例1 壳聚糖的制备
[0032] 将日本枪乌贼软骨表面的组织残留物洗净、烘干，称取97g鱿鱼骨置于过量的4% 的盐酸中浸泡7h，用蒸馏水洗至中性;然后置于过量的1%的氢氧化钠溶液中，90°C水浴反 应2h，用蒸馏水洗净至中性并烘干，即得甲壳素，称重为30.7g，产率为31.6%。称取31.6g 甲壳素，将其粉碎后与45(wt) %的氢氧化钠溶液按照质量体积比1:8的比例混合95°C反 应6小时，获得26. lgP-壳聚糖，产率为85.02 %，紫外光谱法测定脱乙酰度为87.58 %、高效 液相法测定分子量为4574KDa。
[0033] 实施例2不同分子量壳聚糖的制备
[0034] 称取分子量为4574KDa、脱乙酰度为87.58%的壳聚糖，溶解于过量的0.8% (体 积浓度）的盐酸溶液，搅拌溶解直至获得澄清、均质的质量浓度为1.25 %的壳聚糖，然后 加入过氧化氢(使溶液中H2〇2最终体积分数为3 % )，60-70 °C水浴搅拌10-60分钟，得到不同 分子量的壳聚糖，高效液相法测定其分子量分别为8kDa，21 kDa，101 OkDa。
[0035]实施例3不同分子量的P-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备 [0036] (1)磺化试剂的制备
[0037]用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为反应介质制备磺化试剂一一DMF ? S03(二甲基甲酰 胺一氯磺酸)磺化剂。将装有搅拌装置的三口烧瓶置于冰水浴中，三口瓶中加入500mL的N， N-二甲基甲酰胺，在搅拌状态下，滴加100mL氯磺酸，按照1-2滴/秒控制滴加的速度，并使 反应体系的温度保持在〇-5°C。滴加完毕后在室温下继续搅拌至澄清，使磺化试剂更为安全 有效。
[0038]低分子量壳聚糖硫酸酯的制备
[0039]称取不同分子量的壳聚糖原料2g于三口瓶中，加入50ml甲酰胺，搅拌均匀后，加 入5ml甲酸及50ml的磺化剂，混合均匀后，放入微波降解反应器中，在微波辐射条件下，45-70°C反应，然后用反应液2-5倍体积量的无水乙醇沉淀，室温沉化约30min，得到的沉淀物即 是壳聚糖硫酸酯的粗产品。将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，并用2M NaOH溶液将其 中和，透析，浓缩，冷冻干燥得不同分子量的P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖。用高效液相色谱仪 测0-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的分子量(参见表1)。
[0040]表1不同反应条件下不同分子量壳聚糖硫酸酯的制备
[0041]
[0042] 实施例4
[0043]将上述获得的不同分子量的P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖，进行免疫增强活性的测 定，以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，具体为：
[0044] 取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1 X 106个/mL，96孔板每孔接种 100ul。在5%的C02培养箱中培养24h后，加入不同浓度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其终浓 度分别为〇，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做阳性对照，终浓度为lug/ml，均设置3个 复孔。将96孔板继续培养24h后，每孔取lOOul上清液到新的96孔板，加入等体积的Griess试 剂，室温避光放置l〇min，酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线求 出N0量。（参见表2)
[0045] 表2不同分子量的P-C-2,3，6_硫酸酯-壳聚糖对N0表达量的影响
[0047]~不同分子量P-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖均具有非常好的水溶性，且由于硫酸酯基 的加入，其具有非常好的免疫增强活性，具体从上表2可以看出，P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖 能够明显促进细胞产生N0,其产生N0的量为空白对照的2-10倍，上表中分子量为5030的f3-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖免疫增强活性最强，表明P-C-2,3,6-硫酸酯-壳聚糖具有良好的免 疫增强活性。
【主权项】
1. 一种不同分子量e-C-2，3，6-壳聚糖硫酸醋，其特征在于：不同分子量i3-C-2，3，6-硫 酸醋-壳聚糖，其结构式为：其中η为聚合度:2~200;化合物的活性基团一一硫酸醋基(OS〇3^的含量为31.3%~ 36.5%。2. 按权利要求1所述不同分子量i3-C-2，3，6-壳聚糖硫酸醋的制备方法，其特征在于： (1) 横化试剂的制备：将N，N-二甲基甲酯胺在冰水浴中冷却，然后在揽拌条件下滴加 氯横酸，使其在〇-5°C反应;其中N，N-二甲基甲酯胺与氯横酸的体积比为(5:1)-(10:1); (2) 不同分子量的β-壳聚糖的制备:将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后 再加入双氧水，混匀后于60-80°C水浴揽拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖； (3) i3-C-2,3,6-硫酸醋-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入 至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入Ν，Ν-二甲基甲酯胺，揽拌均匀后，再加入上述横 化试剂，混合均匀后在微波福射40-70°C条件下反应，反应后纯化得不同分子量的i3-C-2，3， 6-硫酸醋-壳聚糖； 其中，β-壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N，N-二甲基甲酯胺按质量体积比为1:1 -2.5:20-25: (g: m 1: m 1); β -壳聚糖与横化试剂按质量体积比为1:15 - 2 5 (g: m 1)。3. 按权利要求2所述的不同分子量i3-C-2,3,6-壳聚糖硫酸醋的制备方法，其特征在于： 所述高分子量β-壳聚糖的分子量为2000kDa-4573kDa。4. 按权利要求2或3所述的同分子量i3-C-2,3,6-壳聚糖硫酸醋的制备方法，其特征在 于:所述步骤(3)将分子量低于lOKDa的壳聚糖原料，在40-45°C的微波辅助条件下反应1-3 分钟，得到1000-4000Da分子量的i3-C-2，3，6-壳聚糖硫酸醋； 将分子量在lO-lOOKDa的壳聚糖原料，在45-55Γ的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到 4.5-10邸a的i3-C-2，3，6-壳聚糖硫酸醋； 将分子量在100脚aW上的壳聚糖原料，在45-70°C的微波辅助条件下反应1-5分钟，得 到lO-100邸a的f3-C-2，3，6-壳聚糖硫酸醋。5. 按权利要求2所述的不同分子量i3-C-2,3,6-壳聚糖硫酸醋的制备方法，其特征在于： 所述步骤(3)微波福射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积的无水乙醇，室溫沉化 30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的i3-C-2,3,6-壳聚糖硫酸醋的粗产品；将上述粗 产品抽滤，滤饼用蒸馈水溶解，再用化0田容液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得不同 分子量的0-C-2，3，6-硫酸醋-壳聚糖。
【文档编号】A61P37/04GK105968231SQ201610575095
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】李鹏程, 杨悦, 邢荣娥, 刘松, 于华华, 陈晓琳, 李克成, 秦玉坤, 刘卫翔, 孙雨豪
【申请人】中国科学院海洋研究所