二氧化硅囊泡的合成方法及其用图
【专利摘要】本发明部分涉及产生二氧化硅囊泡的方法，其包括在受控的条件下以从而主要影响囊泡的形态和特性。所述囊泡被显示可有效用作用于化学和生物试剂的递送试剂。它们还被显示可用于治疗方法和用作免疫原性组合物的成分。
【专利说明】二氧化硅囊泡的合成方法及其用途 发明领域
[0001] 本发明涉及化学合成领域。更具体地，本发明涉及合成中空二氧化硅囊泡的方法、 由此产生的二氧化硅囊泡及其在药物递送中和作为免疫原性组合物的一部分的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 在本文中对【背景技术】的任何引述不应被解释为承认这样的技术构成澳大利亚或 其它地方的公知常识。
[0004] 无机中空球体由于其独特的形态和在广泛应用中的潜在用途而已经吸引了相当 多的注意。它们显示出在溶剂和体液中的良好稳定性，具有优异的热性能并且相较于它们 的有机对应物还具有高的机械强度。这些性质已预见到它们在多种应用诸如催化、药物/基 因递送、生物成像、作为纳米反应器、低介电常数材料以及在分离技术中的使用。
[0005]已开发了方法来利用预先形成的模板合成无机中空球体以产生所期望的特性。一 些技术涉及软模板法，包括微胶粒、乳剂、微乳剂等。这种方法有许多缺点，包括需要显著量 的基于化学品的有机溶剂或有机添加剂。硬模板法，包括单晶和胶体球体，也被用于产生具 有所需孔径的球体，随后进行蚀刻步骤以除去硬模板。这样的方法是昂贵的、耗时的和环境 不友好的，并且已被显示提供相对低的产物产率。
[0006] 二氧化硅囊泡是通过在预先形成的模板不存在的情况下通过超分子组装构建的 中空球体类型。具有小粒径(直径通常小于200nm)的二氧化硅囊泡由于它们的低毒性和生 物可降解性而具有潜在的基于细胞的和/或动物应用。中空形态内部的空隙空间可用作用 于货物分子的高容量存储和随后的受控释放的储存器。壁结构(包括壁的厚度和多孔性质） 对于货物分子的固定和释放是至关重要的。然而，对二氧化硅囊泡的壁内的孔径和入口尺 寸的精细控制已经被证明是一个艰难的挑战。
[0007] 提供克服或绕开一个或多个这些问题的具有受控结构的二氧化硅囊泡（SV)用于 以相同方式递送小分子和较大生物分子会是有用的。
[0008] 发明概述
[0009] 根据本发明的第一方面，提供了形成二氧化硅囊泡的方法，其包括以下步骤：
[0010] (a)通过将可水解的二氧化硅源添加至包含嵌段共聚物的水溶液来产生二氧化硅 制剂，将所述二氧化硅制剂保持在低于20°C的温度，并搅动所述制剂直至形成二氧化硅-聚 合物复合囊泡，随后进行步骤(b)或步骤(c);
[0011] (b)升高含有二氧化硅-聚合物复合囊泡的二氧化硅制剂的温度至25°C至100°C， 并搅动混合物以形成在囊泡壁内具有球形结构的二氧化硅-聚合物复合囊泡；
[0012] (c)使所述囊泡暴露于水热处理;和
[0013] (d)煅烧所述囊泡，
[0014] 以由此产生二氧化硅囊泡。
[0015] 根据本发明的第二方面，提供了一种二氧化硅囊泡，其具有：
[0016] (a)30 至 70nm 的粒径；
[0017] (b)通过球形孔穿孔的壁结构;和
[0018] (C)在壁中形成的4至40nm的平均孔入口尺寸。
[0019] 优选地，孔径为40至60nm，更优选为约45至55nm，更优选为约50nm。
[0020] 本发明的第三方面在于通过第一方面的方法产生的二氧化硅囊泡。
[0021] 根据本发明的第四方面，提供了药物或化学品递送系统，其包含第二或第三方面 的二氧化硅囊泡和包封在囊泡内或结合至其外表面的药物或化学剂。
[0022] 优选地，药物是有机药物分子以及化学剂是杀虫剂。
[0023]本发明的第五方面在于包含一个或多个根据第二或第三方面的二氧化硅囊泡和 一个或多个免疫原和/或抗原的免疫原性组合物。
[0024] 优选地，免疫原是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的免疫原性片段。更优选地，免疫原 和/或抗原是BVDV的E2蛋白或其片段。
[0025] 本发明的第六方面在于在受试者中引发免疫应答的方法，其包括施用治疗有效量 的第五方面的免疫原性组合物的步骤。
[0026] 本发明的第七方面在于预防或治疗疾病或病况的方法，其包括给有此需要的受试 者施用治疗有效量的第五方面的免疫原性组合物的步骤。
[0027] 在一个实施方案中，所述疾病或病况是牛病毒性腹泻。
[0028] 本发明的第八方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡以及免疫原在制备用于 治疗疾病或病况的药物中的用途。
[0029]本发明的第九方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡用作佐剂的用途。
[0030] 在上文各个方面中提及的本发明的各种特征和实施方案中视情况而定适应于其 它方面，细节上作必要的修改。因此，视情况而定，在一个方面指定的特征可以与在其它方 面中指定的特征相组合。
[0031] 本发明的其它特征和优势将通过下面的详细描述而变得明显。
[0032] 附图简述
[0033]为了使本发明可以被容易地理解并付诸实践，现在将通过示例的方式参考附图描 述优选的实施方案，其中：
[0034] 图1是新型二氧化硅囊泡(A)SV-10-50和(B)SV-10-50-140在煅烧后的一系列FE- SEM图像；
[0035]图2A-B显示了煅烧之前所合成的SV-10-X-100的一系列TEM图像；
[0036]图3是显示在整个三步合成步骤中二氧化硅囊泡的形成的构设图；
[0037]图 4A-D 显示在煅烧后(A，B)SV-10-50 和(C，D)SV-10-50-140 的一系列 TEM 图像； [0038]图5显示在煅烧后SV-10-T2(A)和SV-10-x-T3(B)的氮吸附等温线图，从N2吸附等 温线计算的孔径分布曲线，（C) sv-l0-T2的1 -30nm范围的从吸附分支的BdB孔径分布曲线， (D) SV-10-X-T3的从脱附分支的B JH孔径分布曲线；
[0039] 图6是SV-10-T2(A)和SV-10-x-T3(B)的l-180nm范围的从吸附分支的BdB孔径分 布；
[0040] 图 7 是在煅烧后分别地(AWV-lO-TOjBWV-lO-x-lOOJOSV-lO-x-nOjDWV-iO-x-lSO 的一系列 TEM 图像；
[0041 ]图 8 是在煅烧后(A)SV-lO-x-lOO-I(水层）、（B)SV-10-x-100-u(TE0S层)和(E)SV-20-x-lOO的一系列TEM图像，（C，D)是在连续搅拌下（C)或在仅10分钟的搅拌和24小时的静 置条件下(D)的步骤1后的反应混合物的图像
[0042] 图9是在(A)添加 TE0S之前和(B-D)在添加 TE0S之后和分别地在12、15和24小时之 后在10°C下反应溶液的一系列低温TEM图像；
[0043] 图10A是在步骤(a)中加入TE0S后在10°C下反应混合物的ATR-FTIR光谱，图10B是 在步骤(b)中在随后的70°C处理中沉淀物的ATR-FTIR光谱，其是在作为时间的函数SV-10-70反应系统中的；
[0044]图11是在煅烧后二氧化硅囊泡中细胞色素 c的吸附量作为时间的函数(T = 25°C) 的图示；
[0045] 图12是分别地(A)纯SV-10-50-140在煅烧后和(B-D)无倾斜(B)和具有+50°(C)和- 50°(D)的X轴中的单一倾斜角的细胞色素 c的SV-10-50-140装载的一系列TEM图像；
[0046]图13是细胞色素 c的SV-10-50装载的TEM图像；
[0047]图 14 是分别地(A)纯液体 n-〇DMS、（B 和 C)SV-10-50 和(D 和 E)SV-10-50-140 在煅烧 后(B和D)或在疏水性修饰后(C和E)的FTIR光谱；
[0048]图15是在疏水性修饰后纯SV-10-50在装载核糖核酸酶A之前(A)和之后(B)的一系 列TEM图像；
[0049] 图16是对照组(A-D)中的、已在24小时内用FITC标记的SV-10-50(E-H)或用SV-10-50-140(I-L)以25ug/ml处理的SCC25细胞的一系列共焦显微镜图像；
[0050] 图17是具有16yg剂量的核糖核酸酶A的SCC25细胞系在24小时和72小时的细胞存 活性的图示；
[0051 ]图18是显示使用MDBK细胞的台盼蓝染色(0.2%)的半定量测定以确定中空二氧化 硅囊泡的细胞毒性的结果的一系列图像；（&)0.511^/11113￥-103-1004;(13)0.111^/11113￥-10-x-100-A;(c)0.01mg/ml SV-10-x-100-A;(d)0.5mg/ml SV-10-x-140;(e)0.1mg/ml SV-lO-x-140; (f)0 ·01mg/ml SV-lO-x-140; (g)0 · 5mg/ml MCM-41 合成的囊泡；（h)单独的不具 有二氧化硅囊泡的MDBK细胞；
[0052]图19是二氧化硅囊泡的吸附和脱附特征的凝胶分析；
[0053]图20是指示小鼠对可能的免疫原性组合物的注射的响应的一系列ELISA测定的结 果的图示；
[0054]图21是来自经免疫的小鼠的鼠脾细胞的抗原特异性IFN- γ分泌的ELISP0T测定的 结果的图示；
[0055]图22是显示SV-140上的οΕ2的吸附的SDS-PAGE凝胶的图像;泳道1-标记物，泳道2-〇Ε2蛋白，泳道3-OE2/SV-140上清液，泳道4-OE2/SV-140沉淀物；
[0056]图23是显示8只动物在第一和第二次免疫后测试血清出血的终点滴定数据的图 示。所有的小鼠以3周间隔对尾基部施用100yL剂量。个体动物的血清从1:100稀释至1: 6400。图中的各个图线代表各组中的个体动物(Ml至M8);
[0057]图24是显示在第二次免疫后维持长期抗体应答的四只动物的血清出血的终点滴 定数据的图示。个体动物的血清从1:100稀释至1:6400。图中的图线代表各组中的四只个体 动物(M5到M8);
[0058]图25是显示通过ELISP0T测定对来自经免疫的小鼠的鼠脾细胞的抗原特异性IFN-γ分泌的检测的图示。Ml至M4是各处理组中的个体小鼠。图中的柱指示在针对 〇E2抗原的应 答中产生IFN-γ的细胞的数目；
[0059]图26是显示通过ELISP0T测定对来自经免疫的小鼠的鼠脾细胞的抗原特异性IFN-γ分泌的检测的图示。Μ5至Μ8是各处理组中的个体小鼠。图中的柱指示在针对ΟΕ2抗原的应 答中产生IFN-γ的细胞的数目；
[0060] 图27是显示免疫组织化学分析以测定经免疫的动物的脾切片中的总IgG的诱导的 一系列图像;〇E2+Quil A阳性处理组a)最终免疫后3周，b)最终免疫后25周；OE2/SV-140纳 米疫苗处理组c)最终免疫后3周，d)最终免疫后25周；未经免疫的组e)最终免疫后3周，f)最 终免疫后25周；
[0061] 图28是显示组织病理学测定以确定纳米疫苗免疫的作用的结果的一系列图像;最 终免疫后3周收集的i)心脏、ii)肾、iii)注射部位、iv)肝脏样品，a) 〇E2+Quil A，c)oE2/SV-140，e)未经免疫的，和最终免疫后25周收集的样品，b)oE2+Quil A，d)oE2/SV-140，f)未经 免疫的；
[0062]图29是显示吸附在4种类型的SV颗粒上的VirB9.2的凝胶图像。吸附后的上清液显 示很少的蛋白残余，表明完全吸附。颗粒泳道显示蛋白吸附。M，SeeBlUe 2标记物。1; VirB9.2蛋白。2; SV100吸附上清液。3; SV100颗粒。4; SV100NH2吸附上清液。5; SV100NH2颗粒。 6; SV140吸附上清液。7; SV140颗粒。8; SV140NH2吸附上清液。9; SV140NH2颗粒；
[0063] 图30是显示在0·l%SLS、37°C过夜下VirB9·2从SV颗粒的脱附的图示。SV100和SV- l40显示最好的脱附。SV100和SV140显示100%脱附；
[0064]图31是显示在以1:4000的稀释度第二次免疫后2周针对VirB9.1蛋白的体液免疫 应答的图示。良好的应答在用具有Quil-A以及SV100的VirB9.1免疫的动物中见到。具有 Quil A的以及混合纳米制剂的两种蛋白的混合注射也产生了类似的特异于VirB9.1的高抗 体应答。在只用VirB9.2蛋白免疫的动物中没有见到交叉反应；
[0065]图32是显示在第二次免疫后针对VirB9.2蛋白的体液免疫应答的图示。良好的应 答在用具有Quil-A以及SV100的VirB9.2免疫的动物中见到。具有Quil A的以及混合纳米制 剂的两种蛋白的混合注射也产生了类似的特异于VirB9.2的高抗体应答。在只用VirB9.1蛋 白免疫的动物中没有见到交叉反应；
[0066]图33是显示针对1:4000稀释的VirB9.1蛋白的体液应答的图示。来自5只小鼠在实 验过程中的平均应答显示测试组的相对免疫应答。免疫前测试出血呈阴性并且抗体应答显 示随注射的增加的趋势。对于单一的和混合的纳米-制剂均观察到该趋势；
[0067]图34是显示针对VirB9.1蛋白的细胞介导的免疫应答的图示。来自5只个体小鼠的 鼠脾细胞的抗原特异性IFN-γ分泌通过ELISP0T测定来测定。（A)用VirB9.1+Quil-A注射的 小鼠显示与VirB9 · 1+SV100以及与多价注射VirB9 · 1/9 · 2+Qui 1-A和VirB9 · 1/9 · 2+SV100相 当的结果。ConA是内部对照。用VirB9.2+QuilA和VirB9.2+SV100注射的动物(B)和（C)单独 的SV100注射的动物和未经免疫的应答显示最小的应答；
[0068]图35是显示针对VirB9.2蛋白的细胞介导的免疫应答的图示。来自5只个体小鼠的 鼠脾细胞的抗原特异性IFN- γ分泌通过ELISP0T测定来测定。（A)用VirB9.2+Quil-A注射的 小鼠显示与VirB9 · 2+SV100以及与多价注射VirB9 · 1/9 · 2+Qui 1-A和VirB9 · 1/9 · 2+SV100相 当的结果。ConA是内部对照。用VirB9.1+QuilA和VirB9.1+SV100注射的动物(B)和(C)单独 的SV100注射的动物和未经免疫的应答显示最小的应答；
[0069] 图36是显示经煅烧的二氧化硅囊泡（圆形）的壁厚度、疏水性修饰之前(菱形)和之 后（正方形）的入口尺寸、未修饰的二氧化硅囊泡上的细胞色素 c吸附容量(倒三角形）和修 饰的二氧化硅囊泡上的核糖核酸酶a(下面的线，三角形)作为T的函数的关系。T是最后合成 步骤的温度；
[0070] 图37是显示溶解或分散于10mM PBS溶液中的游离RNA酶A和装载在疏水性修饰的 二氧化硅囊泡中的RNA酶A(0.5mg/ml RNA酶A)的差示扫描量热曲线的图示，加热速率是60 °C/h；
[0071] 图38是显示用0.01M HCl(pH 2)于65°C处理40分钟并用0.01M NaOH中和至pH 7的 RNA酶A/二氧化硅囊泡的圆二色光谱的图示。最终的RNA酶A浓度为mg/ml。
[0072] 图39是显示用RNA酶A以6μg/ml的剂量处理的（A)SCC25和(B)HCT116细胞在24、48 和7 2小时后的细胞存活性的图示。游离的R N A酶A和在二氧化硅囊泡中装载的R N A酶A用 0.01M HCl(pH2)在65°C下处理40分钟并用0.01M NaOH中和至pH 7,随后添加至细胞；以及 [0073] 图40是显示装载在(A)无修饰的SV-10-120和(B)具有疏水性修饰的SV-10-120-C18 中的RNA酶A在胰蛋白酶消化的处理后的质谱的图示。
[0074] 详述
[0075] 本发明至少部分基于以下发现:对具有高纯度(>98%)和产率、独特的孔壁结构和 可控的孔入口尺寸的相对大孔隙的中空二氧化硅囊泡的形成精确控制通过包括以下步骤 的方法实现:在低温协同自组装以形成二氧化硅-聚合物复合材料的单层囊泡的第一步骤； 第二步骤包括在中等/中间温度下在复合壁内的第二受控自组装过程以形成和定形孔壁结 构；和在需要时，任选的第三步骤，其是在高温下的水热处理过程，其允许对孔入口尺寸的 进一步调整。所提供的新型二氧化硅囊泡已被发现有许多期望的性质，包括高的蛋白装载 能力，优良的细胞摄取和作为药物/化学剂递送系统和作为用于疫苗目的的免疫原性组合 物的一部分的功效。
[0076] 在本专利说明书中，形容词例如第一和第二，左和右，前和后，顶部和底部等，仅用 于从另一元件或方法步骤定义一个元件或方法步骤，而不一定需要由该形容词描述的特定 的相对位置或顺序，除非这从上下文中是清楚的。
[0077] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如将由本发明所属的领 域中普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0078]如本文所用，术语"二氧化硅囊泡"（SV)或"中空二氧化硅囊泡"（HSV)通常是指包 含围绕内腔的基于二氧化硅的壁的囊泡。具体地，本文所述的SV具有介孔范围（即在2至 50nm)的腔，并具有单层二氧化硅-空隙-二氧化硅壁并且可以被分类为小单层囊泡(SUV)， 因为它们的直径小于lOOnm。囊泡壁中的孔隙率通过囊泡壁中的球形穿孔提供。这些球形孔 可以互连，以形成桥接囊泡壁的内表面和外表面的连续孔路径。在其中球形孔的直径类似 于囊泡的壁的厚度的情况下，单个球形孔可以桥接壁的内表面和外表面，从而提供至囊泡 的内腔的大的孔入口。
[0079] 如本文所用，单词"搅动"可指引起试剂在各自反应过程中的混合、扰动或其它动 态移动的任何手段。搅拌是搅动反应混合物的优选手段，虽然超声处理、摇动和其他手段可 以是可接受的。
[0080] 在本文所述的实验工作中，合成的二氧化硅囊泡通常通过它们在合成期间已经历 的处理温度步骤来表示。例如，SV-Tl-T2-T3-n，其中T1、T2和T3分别表示所采用的三个合成 步骤的每一个的温度。后缀η代表特定的样品，例如，"c"代表煅烧后，"a"代表已在样品上进 行了氨基修饰，以及"u"或T指示样品在其中反应混合物包含多于一个相的那些特定情况 下是取自上层还是取自下层。字母"X"表示特定步骤的不存在，取决于"X"在注释中的位置。 例如，SV-lO-x-140表示二氧化硅囊泡通过在10°C下的第一步骤合成，不进行第二步骤而是 将囊泡在第三步骤中经历在140°C下的水热处理，如本文所定义的。
[0081] 在本发明的第一方面，提供了产生中空二氧化硅囊泡的方法，其包括以下步骤：
[0082] (a)通过将可水解的二氧化硅源添加至包含嵌段共聚物的水溶液来产生二氧化硅 制剂，将所述二氧化硅制剂保持在低于20°C的温度，并搅动所述制剂直至形成二氧化硅-聚 合物复合囊泡，随后进行步骤(b)或步骤(c);
[0083] (b)升高含有二氧化硅-聚合物复合囊泡的二氧化硅制剂的温度至25°C至100°C， 并搅动混合物以形成在囊泡壁内具有球形结构的二氧化硅-聚合物复合囊泡；
[0084] (c)使所述囊泡暴露于水热处理;和
[0085] (d)煅烧所述囊泡，
[0086]以由此产生二氧化硅囊泡。
[0087] 可水解的二氧化硅源适当地具有通式[01)(办)31(心）04)]。每个乂基团没有特别 的限制，除了至少两个是可水解的。优选地，四个X基团中的三个是可水解的并且，更优选 地，所有X基团是可水解的。每个X可以是不同的，但是选自以下的有机基团：取代或未取代 的&-&0烷氧基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳 基，取代的或未取代的烯基。优选地，烷氧基、烯基和烷基是指&-C8基团，包括c 2-c8基 团，c3-c8基团，C4-C8基团，c 5-c8基团，c6-c8基团和C7或C8基团。更优选地，烷氧基、烯基和烷 基是&-C6基团，包括c 2-c6基团，c3-c6基团，C4-C6基团和(： 5和〇5基团。甚至更优选地，烷氧基、 烯基和烷基是d-C4基团，包括C2-C4基团和C3和C4基团。更优选地，烷氧基、烯基和烷基可以 是C1-C3,包括Cl、C2和C3基团。还更优选地，烷氧基、烯基和烷基可选自甲基，乙基，丙基，异丙 基，丁基，仲丁基和叔丁基。
[0088] 在一个优选的实施方案中，可水解的二氧化硅源是这样的:所有四个X基团是Ci_C6 烷氧基，包括c2-c6，c3-c6，C4-C6和(： 5和〇5以及Ci-C4，C2-C4和C3和C4和&和(：2基团。优选地，可 水解的二氧化硅源是可任选取代的烷基正硅酸盐。优选地，烷基正硅酸盐选自四甲基正硅 酸盐、四乙基正硅酸盐、四丙基正硅酸盐和四丁基正硅酸盐，所有这些可被任选地取代。
[0089] 术语"烷基"是指具有1至10个碳原子的任选取代的直链和支链烃基。在适当情况 下，烷基可具有指定数目的碳原子，例如，Ci-Cs烷基，或Q-C6烷基，其包括具有以直链或支 链排列的1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。烷基的非限制性实例包括甲基，乙基，丙基，异丙 基，丁基，仲丁基和叔丁基，戊基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，己基，庚基，2-甲基戊基，3-甲基 戊基，4-甲基戊基，2-乙基丁基，3-乙基丁基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷 基，十四烷基，十五烷基。
[0090] 术语"烯基"是指任选取代的不饱和的直链或支链烃基，碳原子数为2至10并且具 有至少一个碳-碳双键。在适当情况下，烯基可以具有指定数目的碳原子，例如，C 2-C8烯基， 或(：2-〇5烯基，其包括具有以直链或支链排列的2、3、4、5或6个碳原子的烯基。烯基的非限制 性实例包括，乙烯基，丙烯基，异丙烯基，丁烯基，仲丁烯基和叔丁烯基，戊烯基，己烯基，庚 - 1,3-一稀，己 _1，3-一稀，壬 _1，3，5-二稀等。
[0091] 如本文所用的术语"烷氧基"意指通过氧原子（即，-0-烷基)连接至硅原子的直链 或支链烷基，其中烷基是如上文所述的。如本文所用的术语"芳氧基"具有与替换烷基的下 文所定义的芳基类似的含义。
[0092] 如本文所用的术语"芳基"是指在每个环中具有最多8个成员的稳定的单环、双环 或三环碳环，其中至少一个环是如Hiickel 4n+2规则所定义的芳族的。
[0093] 术语"任选取代的"包括用选自但不限于烷基、烯基、芳基、胺、氨基、卤化物、硫、羟 基和羧基的一种或多种基团对所提及的基团的取代。本领域技术人员将认识到其它基团可 以用于取代。
[0094] 仅以非限制性实例的方式，可水解的二氧化硅源可选自以下的一种或多种：甲基 三甲氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，甲基三正丙氧基硅烷，甲基三异丙氧基硅烷，甲基三正 丁氧基硅烷，甲基三仲丁氧基硅烷，甲基三叔丁氧基硅烷，乙基三甲氧基硅烷，乙基三乙氧 基硅烷，乙基三正丙氧基硅烷，乙基三异丙氧基硅烷，乙基三正丁氧基硅烷，乙基三仲丁氧 基硅烷，乙基三叔丁氧基硅烷，正丙基三甲氧基硅烷，正丙基三乙氧基硅烷，正丙基三正丙 氧基硅烷，正丙基三异丙氧基硅烷，正丙基三正丁氧基硅烷，正丙基三仲丁氧基硅烷，正丙 基二叔丁氧基硅烷，异丙基二甲氧基硅烷，异丙基二乙氧基硅烷，异丙基二正丙氧基硅烷， 异丙基二异丙氧基硅烷，异丙基二正丁氧基硅烷，异丙基二仲丁氧基硅烷，异丙基二叔丁氧 基硅烷，正丁基三甲氧基硅烷，正丁基三乙氧基硅烷，正丁基三正丙氧基硅烷，正丁基三异 丙氧基硅烷，正丁基三正丁氧基硅烷，正丁基三仲丁氧基硅烷，正丁基三叔丁氧基硅烷，仲 丁基三甲氧基硅烷，仲丁基三乙氧基硅烷，仲丁基三正丙氧基硅烷，仲丁基三异丙氧基硅 烷，仲丁基三正丁氧基硅烷，仲丁基三仲丁氧基硅烷，仲丁基三叔丁氧基硅烷，叔丁基三甲 氧基硅烷，叔丁基三乙氧基硅烷，叔丁基三正丙氧基硅烷，叔丁基三异丙氧基硅烷，叔丁基 三正丁氧基硅烷，叔丁基三仲丁氧基硅烷，叔丁基三叔丁氧基硅烷，异丁基三甲氧基硅烷， 异丁基三乙氧基硅烷，异丁基三正丙氧基硅烷，异丁基三异丙氧基硅烷，异丁基三正丁氧基 硅烷，异丁基三仲丁氧基硅烷，异丁基三叔丁氧基硅烷，正戊基三甲氧基硅烷，正戊基三乙 氧基硅烷，正戊基三正丙氧基硅烷，正戊基三异丙氧基硅烷，正戊基三正丁氧基硅烷，正戊 基三仲丁氧基硅烷，正戊基三叔丁氧基硅烷，仲戊基三甲氧基硅烷，仲戊基三乙氧基硅烷， 仲戊基三正丙氧基硅烷，仲戊基三异丙氧基硅烷，仲戊基三正丁氧基硅烷，仲戊基三仲丁氧 基硅烷，仲戊基三叔丁氧基硅烷，叔戊基三甲氧基硅烷，叔戊基三乙氧基硅烷，叔戊基三正 丙氧基硅烷，叔戊基二异丙氧基硅烷，叔戊基二正丁氧基硅烷，叔戊基二仲丁氧基硅烷，叔 戊基二叔丁氧基硅烷，异戊基二甲氧基硅烷，异戊基二乙氧基硅烷，异戊基二正丙氧基娃 烧，异戊基二异丙氧基硅烷，异戊基二正丁氧基硅烷，异戊基二仲丁氧基硅烷，异戊基二叔 丁氧基硅烷，新戊基二甲氧基硅烷，新戊基二乙氧基硅烷，新戊基二正丙氧基硅烷，新戊基 三异丙氧基硅烷，新戊基三正丁氧基硅烷，新戊基三仲丁氧基硅烷，新戊基三叔丁氧基硅 烷，苯基三甲氧基硅烷，苯基三乙氧基硅烷，苯基三正丙氧基硅烷，苯基三异丙氧基硅烷，苯 基三正丁氧基硅烷，苯基三仲丁氧基硅烷，苯基三叔丁氧基硅烷，二甲基二甲氧基硅烷，二 甲基二乙氧基硅烷，二甲基二正丙氧基硅烷，二甲基二异丙氧基硅烷，二甲基二正丁氧基硅 烧，^甲基^仲丁氧基硅烷，^甲基^叔丁氧基硅烷，^乙基^甲氧基硅烷，^乙基^乙氧 基硅烷，^乙基^正丙氧基硅烷，^乙基^异丙氧基硅烷，^乙基^正丁氧基硅烷，^乙基 二仲丁氧基硅烷，二乙基二叔丁氧基硅烷，二正丙基二甲氧基硅烷，二正丙基二乙氧基硅 烷，二正丙基二正丙氧基硅烷，二正丙基二异丙氧基硅烷，二正丙基二正丁氧基硅烷，二正 丙基^仲丁氧基硅烷，^正丙基^叔丁氧基硅烷，^异丙基^甲氧基硅烷，^异丙基^乙氧 基硅烷，^异丙基^正丙氧基硅烷，^异丙基^异丙氧基硅烷，^异丙基^正丁氧基硅烷， 二异丙基二仲丁氧基硅烷，二异丙基二叔丁氧基硅烷，二正丁基二甲氧基硅烷，二正丁基二 乙氧基硅烷，二正丁基二正丙氧基硅烷，二正丁基二异丙氧基硅烷，二正丁基二正丁氧基硅 烷，二正丁基二仲丁氧基硅烷，二正丁基二叔丁氧基硅烷，二仲丁基二甲氧基硅烷，二仲丁 基二乙氧基硅烷，二仲丁基二正丙氧基硅烷，二仲丁基二异丙氧基硅烷，二仲丁基二正丁氧 基硅烷，二仲丁基二仲丁氧基硅烷，二仲丁基二叔丁氧基硅烷，二叔丁基二甲氧基硅烷，二 叔丁基二乙氧基硅烷，二叔丁基二正丙氧基硅烷，二叔丁基二异丙氧基硅烷，二叔丁基二正 丁氧基硅烷，二叔丁基二仲丁氧基硅烷，二叔丁基二叔丁氧基硅烷，二苯基二甲氧基硅烷， ^苯基^乙氧基硅烷，^苯基^正丙氧基硅烷，^苯基^异丙氧基硅烷，^苯基^正丁氧基 硅烷，^苯基^仲丁氧基硅烷，^苯基^叔丁氧基硅烷，甲基新戊基^甲氧基硅烷，甲基新 戊基二乙氧基硅烷，甲基二甲氧基硅烷，乙基二甲氧基硅烷，正丙基二甲氧基硅烷，异丙基 二甲氧基硅烷，正丁基二甲氧基硅烷，仲丁基二甲氧基硅烷，叔丁基二甲氧基硅烷，异丁基 ^甲氧基硅烷，正戊基^甲氧基硅烷，仲戊基^甲氧基硅烷，叔戊基^甲氧基硅烷，异戊基 二甲氧基硅烷，新戊基二甲氧基硅烷，新己基二甲氧基硅烷，环己基二甲氧基硅烷，苯基二 甲氧基硅烷，甲基^乙氧基硅烷，乙基^乙氧基硅烷，正丙基^乙氧基硅烷，异丙基^乙氧 基硅烷，正丁基二乙氧基硅烷，仲丁基二乙氧基硅烷，叔丁基二乙氧基硅烷，异丁基二乙氧 基硅烷，正戊基^乙氧基硅烷，仲戊基^乙氧基硅烷，叔戊基^乙氧基硅烷，异戊基^乙氧 基硅烷，新戊基^乙氧基硅烷，新己基^乙氧基硅烷，环己基^乙氧基硅烷，苯基^乙氧基 硅烷，二甲氧基硅烷，二乙氧基硅烷，二正丙氧基硅烷，二异丙氧基硅烷，二正丁氧基硅烷， 三仲丁氧基硅烷，三叔丁氧基硅烷。在上述化合物中，优选的化合物是甲基三甲氧基硅烷， 甲基三乙氧基硅烷，甲基三正丙氧基硅烷，甲基三异丙氧基硅烷，乙基三甲氧基硅烷，乙基 三乙氧基硅烷，二甲基二甲氧基硅烷，二甲基二乙氧基硅烷，二乙基二甲氧基硅烷和二乙基 二乙氧基硅烷。
[0095] 可水解的二氧化硅源可以是由上述式描述或上面列出的单体的一种或多种类型 的反应而形成的低聚物。
[0096] 优选地，水溶液是含水缓冲溶液。
[0097] 合适地，含水缓冲溶液是酸性缓冲溶液。在优选的实施方案中，含水缓冲溶液的pH 为3至6,或3至5,优选4至5。在一个优选实施方案中，含水缓冲溶液是乙酸钠/乙酸缓冲溶 液。
[0098] 优选地，无机盐也存在于二氧化硅制剂中。合适的无机盐包括钠和钾盐。硫酸钠和 氯化钠是优选的盐的两个例子。据推测，制剂中的高离子强度改善较大的囊泡稳定性并且 帮助维持均匀性。这基于以下实验观察:在盐不存在的情况下，虽然仍然是商业上有用的， 但囊泡将变得相对小(30nm)并显示减少的均匀性。
[0099] 优选地，嵌段共聚物是烯烃嵌段共聚物。广泛多样的烯烃嵌段共聚物是商购可得 的。更优选地，嵌段共聚物是三嵌段共聚物，即，A-B-A结构的嵌段共聚物。在一个实施方案 中，三嵌段共聚物为聚(氧化烯0-聚(氧化烯 2)_聚(氧化烯:)嵌段共聚物，其中烯基i和烯基2 成分可独立地选自乙烯，丙烯，丁烯，戊烯，己烯及其衍生物，例如二醇衍生物。
[0100]甚至更优选地，嵌段共聚物是聚(氧化乙烯)_聚(氧化烯烃)_聚(氧化乙烯)嵌段共 聚物，其中烯基是如上文对于烯基:和烯基2成分所描述的。在优选的实施方案中，嵌段共聚 物是聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)或聚(氧化乙烯)-聚(氧化丁烯)-聚(氧化 乙烯)嵌段共聚物。
[0101]优选地，在步骤(a)中，二氧化硅制剂被保持在0至20°C的温度下，优选在5°C至15 °C，更优选在约 10°(：。0至20°C可包括0°C至 15°C、0°C至 12°C、5°C至20°C、5°C至 15°C、7°C至 13°C的范围，并且包括约0°C，1°C，2°C，3°C，4°C，5°C，6°C，7°C，8°C，9°C，10°C，11°C，12°C， 13 °C，14 °C，15 °C，16 °C，17 °C，18 °C，19 °C和20 °C或从这些值中的任何一个到这些值中的另 一个的范围的温度。
[0102]合适地，步骤(a)中混合物的搅动是搅拌。优选地，搅拌直到发生二氧化硅-聚合物 复合囊泡的形成是第一预定时间段的连续搅拌。第一预定时间段可以通过已知的技术例如 TEM观察反应混合物直到观察到二氧化硅-聚合物复合囊泡的形成来实验地确定。未能连续 搅拌制剂可导致制剂相分离至层，这扰乱囊泡的形成。
[0103] 合适地，将二氧化硅制剂搅拌第一预定时间段的显著部分，优选大部分，更优选实 质部分和甚至更优选基本上所有的第一预定时间段。
[0104] "显著部分"意指搅拌在第一预定时间段的至少前20%是连续的。"大部分"意指搅 拌在第一预定时间段的至少前50%是连续的。"实质部分"意指搅拌在第一预定时间段的至 少前75%是连续的。"基本上所有的"意指搅拌在第一预定时间段的至少前80%，优选90% 是连续的。
[0105]本发明人已令人惊讶地发现，连续搅拌是至少第一步骤的关键方面，并且重要的 是保持连续搅拌直到大部分的初始二氧化硅-聚合物复合囊泡已形成。本发明人已实验地 显示，在其它条件保持相同的情况下，如果反应在不搅拌的情况下进行，那么所需的囊泡不 能形成并导致无定形二氧化娃。这在实验部分中进行了描述。
[0106] 优选地，第一预定时间段是至少5小时，更优选至少10小时，甚至更优选至少15小 时，还更优选至少20小时。在一个优选的实施方案中，第一预定时间段是约24小时或更长时 间。
[0107] 合适地，在步骤(b)中，将温度升高到30°C至90°C，优选30°C至85°C，更优选35°C至 80°(：。30°(：至90°(：可以包括30°(：至80°(：，30°(：至75°(：，30°(：至70°(：，40°(：至90°(：，40°(：至85 °C，40°C至80°C，40°C至75 °C，40 °C至70°C 的范围并且包括约30°C，35°C，40°C，45°C，50 °C， 55°C，60°C，65°C，70°C，75°C，80°C，85°C和90°C或从这些值中的任何一个到这些值中的另 一个的范围的温度。
[0108] 合适地，步骤(b)中混合物的搅动是搅拌。优选地，持续搅拌直到球形结构的形成 在二氧化硅-聚合物复合囊泡的壁内产生。该形成可在连续搅拌持续第二预定时间段之后 发生。
[0109] 优选地，第二预定时间段为约0.1至约6.0小时，优选约0.5至约5.0小时，更优选约 1.0至约4.0小时，甚至更优选约2.0至约3.0小时。第二预定时间段也可以通过实验确定，如 对于第一预定时间段的那样，并且可以被视为在形成合适百分比的具有壁球形结构的囊泡 时结束，例如在大于所述囊泡的90%、95%或98%时结束。
[0110] 本发明人已发现，步骤(b)中在中等/中间温度下的加热是孔壁结构形成发生（即 在壁结构内形成中空球形体)的时期，并且升高温度超过步骤(a)中的温度是实现所需囊泡 壁形态至关重要的。不希望受到理论的限制，本发明人认为，在步骤(a)结束时，二氧化硅-聚合物复合囊泡中的二氧化硅物质可能不是充分水解的，而是仍然保留一些它们的二氧化 硅前体有机基团和因此一定程度的疏水性。在这些条件下，嵌段共聚物的层状结构是有利 的。然而在步骤(b)的情况下，二氧化硅前体的水解程度增加，以使得二氧化硅的表面变得 更由二氧化硅表面典型的羟端基占主导地位，并因此更具亲水性。在壁的疏水性这样的减 小的情况下，表面活性剂构象可改变成更弯曲的结构，例如亲水性条件下有利的球形胶束。 这导致形成具有球形结构的囊泡壁孔。本领域技术人员将理解的是，取决于表面活性剂的 选择、温度、含水量、二氧化硅前体水解的程度和其它因素，可在步骤(b)形成弯曲的表面活 性剂结构而非球形胶束，并且像这样，囊泡壁的多孔性可呈现这些弯曲表面活性剂结构的 形状。可以形成作为球形胶束的替代物的弯曲表面活性剂结构包括不限于六角形棒和立方 相，包括双连续立方相。可以形成的弯曲表面活性剂结构的程度将由表面活性剂液晶行为 的本领域技术人员很好的理解。
[0111] 然而，在一个实施方案中，方法包括步骤(a)，随后步骤(c)，然后煅烧囊泡。在这 里，步骤(c)(水热步骤)对于在囊泡壁中形成较大的球形孔是关键的。在仅期望通过本发明 的方法所提供的范围的较大端点的孔径的情况下，步骤(b)(其在无随后的水热步骤的情况 下产生较小的孔径)可以从方法中省去。
[0112] 在一个高度优选的实施方案中，方法包括步骤(a)，随后步骤(b)，随后步骤(c)，然 后煅烧囊泡。即，步骤(a)的二氧化硅制剂被暴露于步骤(b)，并且作为步骤(b)的产物的具 有囊泡壁内的球形结构的二氧化硅-聚合物复合囊泡然后被暴露于步骤(c)。
[0113] 优选地，对于所有实施方案，步骤(c)的水热处理在大于90°C且小于200°C的温度 下进行，优选大于90°C并小于180°C，更优选大于95°C并小于160°C，例如约100°C至约160 °C。在某些实施方案中，水热处理可以在100°C至200°C的温度下进行，优选100°C至180°C， 更优选 l〇(TC 至 16(TC。约 100。(：，105。(：，110。(：，115。(：，120。(：，125。(：，130。(：，135。(：，140。(：， 145 °C，150 °C，155 °C和160 °C的温度被认为是有用的。
[0114] 优选地，进行水热处理步骤持续第三预定时间段，直到形成具有在整个硅质壁中 形成的入口的二氧化硅-聚合物复合囊泡。
[0115] 优选地，第三时间段通常等于对于第一时间段所述的那些时间段。
[0116]适当地，水热步骤(c)在升高的压力下进行。优选地，升高的压力大于0.7巴并小于 15.5巴，包括1.1巴至15.0巴，1.5巴至12.0巴，1.5巴至10.0巴，1.5巴至8.0巴，1.5巴至6.0 巴和1.5巴至5.0巴。在一个实施方案中，升高的压力大于0.7巴并小于10巴，更优选大于0.8 巴并小于6巴，例如约1巴至约6巴。
[0117] 如图3所示，进行步骤(b)而不进行附加的水热步骤可导致在囊泡壁中形成相对小 的孔，通常直径小于4nm。这些孔主要是由囊泡壁中的微裂纹形成，并且微裂纹可以与囊泡 壁中的小的内部球形腔相关联，以使得这些腔与囊泡的内部腔和囊泡的外部连接，从而形 成通过囊泡壁的连续孔道。在包括或不包括步骤(b)的情况下进行水热步骤（即，在步骤(a) 或步骤(b)之后)可导致如图3所示的在囊泡壁中形成较大的孔。因此，虽然步骤(b)或步骤 (c)可以直接在步骤(a)之后并且随后进行煅烧以产生可用的和具有商业价值的产品，优选 的是在步骤(a)之后进行步骤(b)，随后进行步骤(c)，并且然后，最后进行煅烧以产生形态 精细控制的二氧化硅囊泡。
[0118] 适当地，煅烧在适合除去共聚物模板的任何温度下进行，并且通常将在大于400 °C，优选大于500°C下进行，甚至更优选约550°C的温度下进行。
[0119] 本领域技术人员将理解，对在本发明的方法的各个阶段形成的二氧化硅的提及可 以指基于硅-氧的材料，例如基于硅-氧的物质的部分浓缩和水合的形式，因为近似组成 Si02的二氧化硅不会期望被完全形成直到进行煅烧。在本发明的方法的不同阶段形成的基 于硅-氧的材料对于知晓使用已知的途径例如水解和缩合从本文描述的二氧化硅前体形成 二氧化硅的技术人员而言是熟知的。
[0120] 二氧化硅囊泡的表面修饰可以任选地按照下列煅烧步骤进行。这通常涉及增加二 氧化硅囊泡的表面的疏水性，这已被发现增加某些蛋白和药物化合物的可装载量。表面修 饰可以被应用于二氧化硅囊泡的外表面或内表面或两者。在一个高度优选的实施方案中， 方法包括，在二氧化硅囊泡的煅烧后，用适当的官能团修饰二氧化硅囊泡的步骤。优选地， 表面修饰为疏水性修饰。
[0121] 用于修饰二氧化硅囊泡表面的化学剂可以是具有通式[(XdUdSUXdUJ]的可 水解的二氧化硅源。每个X基团没有特别的限制，除了至少一个是可水解的并且至少一个是 疏水性官能团。每个可水解的X可以是不同的，但为选自取代或未取代的C1-C4烷氧基和卤素 取代基的有机基团。优选地，所提及的烷氧基是甲氧基和乙氧基。更优选地，烷氧基是甲氧 基。优选地，所提及的卤素基团是氯化物和溴化物基团。更优选地，卤素基团是氯化物基团。 或者，每个疏水性官能X基团可以是不同的，但为选自取代或未取代的Q-C20烷基的有机基 团。用于对二氧化硅囊泡施加表面修饰的可水解的二氧化硅源可以包括但不限于一种下列 化合物或两种或多种下列化合物的组合：甲基三甲氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，乙基三甲 氧基硅烷，乙基二乙氧基硅烷，丙基二甲氧基硅烷，丙基二乙氧基硅烷，丁基二甲氧基硅烷， 丁基三乙氧基硅烷，戊基三甲氧基硅烷，戊基三乙氧基硅烷，己基三甲氧基硅烷，己基三乙 氧基硅烷，庚基三甲氧基硅烷，庚基三乙氧基硅烷，辛基三甲氧基硅烷，辛基三乙氧基硅烷， 壬基三甲氧基硅烷，壬基三乙氧基硅烷，癸基三甲氧基硅烷，癸基三乙氧基硅烷，十一烷基 三甲氧基硅烷，十一烷基三乙氧基硅烷，十二烷基三甲氧基硅烷，十二烷基三乙氧基硅烷， 十三烷基三甲氧基硅烷，十三烷基三乙氧基硅烷，十四烷基三甲氧基硅烷，十四烷基三乙氧 基硅烷，十五烷基二甲氧基硅烷，十五烷基二乙氧基硅烷，十八烷基二甲氧基硅烷，十八烧 基三乙氧基硅烷，十七烷基三甲氧基硅烷，十七烷基三乙氧基硅烷，十八烷基三甲氧基硅 烷，十八烷基三乙氧基硅烷，苯基三甲氧基硅烷，苯基三乙氧基硅烷，二甲基二甲氧基硅烷， ^甲基^乙氧基硅烷，^乙基^甲氧基硅烷，^乙基^乙氧基硅烷，^丙基^甲氧基硅烷， ^丙基^乙氧基硅烷，^丁基^甲氧基硅烷，^丁基^乙氧基硅烷，^戊基^甲氧基硅烷， ^?戊基^乙氧基硅烷，^己基^甲氧基硅烷，^己基^乙氧基硅烷，^庚基^甲氧基硅烷， 二庚基二乙氧基硅烷，二辛基二甲氧基硅烷，二辛基二乙氧基硅烷，二壬基二甲氧基硅烷， 二壬基二乙氧基硅烷，二癸基二甲氧基硅烷，二癸基二乙氧基硅烷，二-十一烷基二甲氧基 硅烷，^十一烷基^乙氧基硅烷，^十^烷基^甲氧基硅烷，^十^烷基^乙氧基硅烷， 二-十三烷基二甲氧基硅烷，二-十三烷基二乙氧基硅烷，二-十四烷基二甲氧基硅烷，二-十 四烷基^乙氧基硅烷，^十五烷基^甲氧基硅烷，^十五烷基^乙氧基硅烷，^十八烧 基^甲氧基硅烷，^·_十八烷基^乙氧基硅烷，^十七烷基^甲氧基硅烷，^十七烷基^-乙氧基硅烷，二-十八烷基二甲氧基硅烷，二-十八烷基二乙氧基硅烷，二苯基二甲氧基硅 烷，二苯基二乙氧基硅烷，乙基甲基二甲氧基硅烷，乙基甲基二乙氧基硅烷，丙基甲基二甲 氧基硅烷，丙基甲基二乙氧基硅烷，丁基甲基二甲氧基硅烷，丁基甲基二乙氧基硅烷，戊基 甲基二甲氧基硅烷，戊基甲基二乙氧基硅烷，己基甲基二甲氧基硅烷，己基甲基二乙氧基硅 烷，庚基甲基二甲氧基硅烷，庚基甲基二乙氧基硅烷，辛基甲基二甲氧基硅烷，辛基甲基二 乙氧基硅烷，壬基甲基二甲氧基硅烷，壬基甲基二乙氧基硅烷，癸基甲基二甲氧基硅烷，癸 基甲基^乙氧基硅烷，十一烷基甲基^甲氧基硅烷，十一烷基甲基^乙氧基硅烷，十^烷基 甲基二甲氧基硅烷，十二烷基甲基二乙氧基硅烷，十三烷基甲基二甲氧基硅烷，十三烷基甲 基^乙氧基硅烷，十四烷基甲基^甲氧基硅烷，十四烷基甲基^乙氧基硅烷，十五烷基甲基 ^甲氧基硅烷，十五烷基甲基^乙氧基硅烷，十八烷基甲基^甲氧基硅烷，十八烷基甲基^-乙氧基硅烷，十七烷基甲基^甲氧基硅烷，十七烷基甲基^乙氧基硅烷，十八烷基甲基^甲 氧基硅烷，十八烷基甲基^乙氧基硅烷，苯基甲基^甲氧基硅烷，苯基甲基^乙氧基硅烷， 三甲基氯硅烷，乙基二甲基氯硅烷，丙基二甲基氯硅烷，丁基二甲基氯硅烷，戊基二甲基氯 硅烷，己基二甲基氯硅烷，庚基二甲基氯硅烷，辛基甲基二乙氧基硅烷，壬基二甲基氯硅烷， 癸基二甲基氯硅烷，十一烷基二甲基氯硅烷，十二烷基二甲基氯硅烷，十三烷基二甲基氯硅 烧，十四烷基^甲基氣硅烷，十五烷基^甲基氣硅烷，十八烷基^甲基氣硅烷，十七烷基^-甲基氯硅烷，十八烷基二甲基氯硅烷，苯基二甲基氯硅烷，苯乙基二甲基氯硅烷，二甲基二 氯硅烷，乙基甲基二氯硅烷，丙基甲基二氯硅烷，丁基甲基二氯硅烷，戊基甲基二氯硅烷，己 基二甲基二氯硅烷，庚基甲基二氯硅烷，辛基甲基二乙氧基硅烷，壬基甲基二氯硅烷，癸基 甲基二氯硅烷，十一烷基甲基二氯硅烷，十二烷基甲基二氯硅烷，十三烷基甲基二氯硅烷， 十四烷基甲基二氯硅烷，十五烷基甲基二氯硅烷，十六烷基甲基二氯硅烷，十七烷基甲基二 氯硅烷，十八烷基甲基二氯硅烷，苯基甲基二氯硅烷，苯乙基甲基二氯硅烷，甲基三氯硅烷， 乙基三氯硅烷，丙基三氯硅烷，丁基三氯硅烷，戊基三氯硅烷，己基三氯硅烷，庚基三氯硅 烷，辛基甲基二乙氧基硅烷，壬基三氯硅烷，癸基三氯硅烷，十一烷基三氯硅烷，十二烷基三 氣硅烷，十二烷基二氣硅烷，十四烷基二氣硅烷，十五烷基二氣硅烷，十八烷基二氣硅烷，十 七烷基三氯硅烷，十八烷基三氯硅烷，苯基三氯硅烷，苯乙基三氯硅烷。
[0122] 合适地，二氧化硅囊泡的表面修饰通过将二氧化硅囊泡与用于表面修饰的可水解 试剂在合适的介质中组合以促进气相或液相反应来进行。在表面修饰在液相介质中进行的 情况下，二氧化硅囊泡被加入到适当的溶剂(对于可水解的二氧化硅源）中并且含有二氧化 硅囊泡的混合物的搅动可以在添加用于表面修饰的可水解试剂之前和/或之后进行。或者， 二氧化硅囊泡可以加入到已含有将用于实现疏水性修饰的试剂的溶剂中。优选地，在表面 修饰步骤中混合物的搅动通过搅拌或超声处理进行。更优选地，在表面修饰步骤中混合物 的搅动通过搅拌进行。
[0123] 合适地，在表面修饰步骤中，温度可以升高到80°C至120°C，优选100°C至120°C，更 优选 105°C 至 115°C。
[0124] 合适地，表面修饰步骤可在一种有机溶剂或两种或更多种有机溶剂的组合中进 行。可以使用的溶剂包括，但不限于下述的一种或下述的两种或更多种的组合:戊烷，2-甲 基丁烷，新戊烷，正己烷，2-甲基戊烷，3-甲基戊烷，2，2-二甲基丁烷，2，3-二甲基丁烷，正庚 烷，2-甲基己烷，3-甲基己烷，2,2_二甲基戊烷，2,3_二甲基戊烷，2,4_二甲基戊烷，3,3_二 甲基戊烷，3-乙基戊烷，2,2,3_三甲基丁烷，辛烷，2-甲基庚烷，3-甲基庚烷，4-甲基庚烷，3-乙基己烧，2，2_二甲基己烧，2，3_二甲基己烧，2，4_二甲基己烧，2，5_二甲基己烧，3，3_二甲 基己烧，3，4_二甲基己烧，3_乙基_2_甲基戊烧，3_乙基_3_甲基戊烧，2，2，3_二甲基戊烧，2， 2,4_三甲基戊烷，2,3,3_三甲基戊烷，2,3,4_三甲基戊烷，四甲基丁烷，壬烷，癸烷，十一烷， 十二烷，乙醇，丙-1-醇，异丙醇，丁醇，戊醇，己-1-醇，庚-1-醇，辛-1-醇，壬-1-醇，癸-1-醇， ^ 碳-I-醇，十二烧-I-醇，苯，甲苯，乙苯，1,2-二甲苯，1,3-二甲苯，1,4-二甲苯，正丙苯， 1，2，3-三甲苯，1，3，5-三甲苯，1，2，4-三甲苯，苄醇。优选地，溶剂是取代或未取代的C 5-C16 烷烃或C2-C12醇，或芳族化合物，其是取代或未取代的&-(：3。更优选地，溶剂是(： 2-(：8醇，或芳 族化合物，其是取代的&-C3,甚至更优选地是&-(： 5醇或&-C3取代的苯。溶剂优选是辛烷，乙 醇，丙-1-醇，异丙醇或甲苯或这些的一种或多种的组合。
[0125] 对于二氧化硅囊泡的形成，在实验部分呈现的结果，特别是在图8中所示的那些， 清楚地表明，连续搅拌直到形成二氧化硅聚合物囊泡以及低温是囊状结构的形成和高产率 的两个关键参数。
[0126] 在表面活性剂的自组装中，超分子聚集体的结构主要通过有机表面活性剂分子的 g因子预测。本发明人已经证明，在ΡΕ0-ΡΒ0-ΡΕ0型嵌段共聚物模板系统中，协同地自组织的 嵌段共聚物/硅酸盐复合结构可以被二氧化硅前体的疏水性/亲水性影响。具体地，本发明 人推测温度，在该实例中第一步骤的相对低的温度，将影响TE0S的水解率，这进而影响成形 二氧化硅低聚物的疏水性/亲水性并因此影响囊状结构的自组装。在合成步骤(a)中，较高 的温度导致较快的TE0S水解率，这产生亲水性二氧化硅低聚物，因此不期望地生成管状的 和无定形的二氧化硅结构，而如前所定义的较低温度可产生所需的囊泡结构。虽然高温水 热处理可以改变孔入口尺寸，但在步骤(a)后的直接水热处理阻止孔壁结构内球形体的形 成，从而产生仍然商业上有用的但不太优选的囊泡结构。在中等或"中间"温度，如在步骤 (b)中，夹心状二氧化硅/表面活性剂复合结构提供了直接的证据表明TE0S沉积在表面活性 剂层的两侧，从而在随后煅烧期间除去聚合物后产生二氧化硅-空隙-二氧化硅壁结构。
[0127] 为了可视化SV形成机制，低温TEM被用来研究在整个过程中在不同时间的成形囊 泡结构。如图9A中所示，在添加二氧化硅源（TE0S)前，嵌段共聚物表面活性剂为直径小于 lOnm的胶束形式。这表明，本发明的方法在合成中不使用预先形成的囊泡模板，而是二氧化 硅囊泡的形成是表面活性剂和二氧化硅低聚物的协同自组装。添加 TE0S后15小时，可以观 察到自组装的二氧化硅-表面活性剂囊泡（图9C)，但是，在步骤1结束时没有观察到孔壁结 构（图9D)。还清楚的是孔壁结构中的球形体仅在中等温度下的后续处理即步骤(b)或T2中 形成(如在图3所示的）。
[0128] 根据本发明的第二方面，提供了一种二氧化硅囊泡，其具有：
[0129] (a)30 至 70nm 的粒径；
[0130] (b)通过球形孔穿孔的壁结构;和
[0131] (c)在壁中形成的4至40nm的平均孔入口尺寸。
[0132] 优选地，孔径为40至60nm，更优选为约45至55nm，更优选为约50nm。这是促进囊泡 和伴随的化学或生物试剂通过内吞作用的细胞摄取的理想尺寸。
[0133] 合适地，平均孔入口尺寸是5至38nm，更优选约6至约34nm。优选的孔入口尺寸将取 决于待容纳的蛋白或其它药物或生物分子的尺寸。例如，对于均具有约3nm尺寸的细胞色素 c和核糖核酸酶A，具有约6nm的平均孔入口尺寸的SV将是优选的。对于其中较大的分子需要 被容纳的应用，具有8、12、16、24或34歷的平均孔入口尺寸的3￥可以是更合适的。
[0134]二氧化硅囊泡是中空二氧化硅囊泡。
[0135] 优选地，中空二氧化娃囊泡具有4至15nm，更优选5至14nm，甚至更优选7至13nm的 壁厚度。
[0136] 本发明的第三方面在于通过第一方面的方法产生的二氧化硅囊泡。二氧化硅囊泡 将具有已对于第二方面的那些所概述的物理特性。
[0137] 根据本发明的第四方面，提供了药物或化学品递送系统，其包含第二或第三方面 的二氧化硅囊泡和包封在囊泡内或结合至其外表面的药物或化学剂
[0138] 优选地，药物是有机分子并且可包括"生物"分子例如蛋白和肽及其片段。
[0139] 优选地，化学剂是杀虫剂例如杀白蚁剂。
[0140] 药物或化学剂可被吸附或结合到中空二氧化硅囊泡的外表面，捕获在孔内或包封 在囊泡腔内。它可以是共价键合的，但优选是可释放地结合，例如通过离子吸引或静电相互 作用或简单地物理陷入在孔结构内从而提供缓慢释放特性。
[0141] 本发明的第五方面在于包含一个或多个根据第二或第三方面的二氧化硅囊泡和 一个或多个免疫原和/或抗原的免疫原性组合物。
[0142] 免疫原可以是任何分子、蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质或任何这些物质的片 段，其可以在施用给受试者时后在受试者中引发免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答可 以是保护性免疫应答。免疫原可来源于病原体、细胞、组织或器官，可以是纯化的抗原、细胞 裂解物或培养滤液，或者可以是重组或合成来源的。
[0143] 在一个实施方案中，免疫原或抗原可以是免疫原或抗原的组合。
[0144] 在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗组合物。
[0145] 在一个实施方案中，免疫原性疫苗组合物是多价疫苗组合物。
[0146] 在一个实施方案中，免疫原来源于病原性病毒、细菌或其它生物体。适当地，免疫 原所来源于的病原体是单链RNA病毒。优选地，病毒选自黄病毒科，肝炎病毒，Pegivirus，短 暂热病毒属，弹状病毒科和痕病毒属。在一个优选的实施方案中，病毒是痕病毒。
[0147] 当病毒是短暂热病毒属或弹状病毒科病毒时，它可以是牛流行热致病病毒。牛流 行热(BEF)也被称为牛中的三日热病。它是牛的节肢动物媒介传播疾病。BEF病毒是具有脂 质包膜和5种结构蛋白的负单链RNA基因组。包膜糖蛋白G包含类型特异性和中和性抗原位 点。
[0148] 在某些实施方案中，免疫原可来源于巴贝虫属(Babesia)的物种。这样的寄生生物 可以是，例如，牛巴贝虫或二联巴贝虫。
[0149] 在某些实施方案中，免疫原可来源于立克次体目（Rickettsiales)的物种。该物种 可以是无形体属(Anap 1 asma)的，例如，边缘无形体(Anap 1 asma margina 1 e)。边缘无形原体 对牛的感染导致通常被称为无形体病的疾病。
[0150] 将理解的是，本发明的免疫原性组合物不限于它可以与其使用的免疫原/抗原的 类型。可与HSV药物递送系统使用的抗原的实例包括但不限于，在治疗或预防以下的过程中 使用的那些:腺病毒4型和7型，炭疽，肺结核，白喉和破伤风，百日咳，乙型肝炎，脊髓灰质炎 病毒，流感嗜血杆菌，脑膜炎球菌病，甲型肝炎，人乳头瘤病毒，流感，日本脑炎，麻疹，腮腺 炎和风疹，肺炎球菌病，狂犬病，轮状病毒，天花，伤寒，水痘，黄热病，猪圆环病毒，猪瘟病 毒，马流感病毒，手足口病病毒，新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒3，马流感病毒， 狂犬病毒，犬瘟热病毒，猪传染性胸膜肺炎（由胸膜炎肺炎放线杆菌引起），犬巴贝虫病和犬 内脏利什曼病。
[0151 ]在使用本发明的二氧化硅囊泡的产品的任何一种制剂或本文描述的与二氧化硅 囊泡的使用相关的任何组合物或方面中，可以存在多于一种药物分子或免疫原。这里，不同 免疫原的组合、不同药物分子的组合或免疫原和药物的组合可以在单一制剂中使用。这使 得能够开发多价疫苗、多药物组合和药物疫苗组合。多药物组合、多价疫苗和药物疫苗组合 可以通过将药学活性分子(即，药物分子，免疫原或其它分子)混合在一起，然后将这些装载 到二氧化硅囊泡以使得个体囊泡可包含多于一种类型的活性分子，或可替代地，单一类型 的活性分子可以单独吸附(加载)到单独批次的二氧化硅囊泡，然后用不同活性分子装载的 二氧化硅囊泡可以被组合到单一制剂中。该后一种方法允许不同二氧化硅囊泡设计与不同 的活性分子一起使用，以使得每个活性分子在制剂中的释放可以相对于制剂中其它活性分 子的释放特征来独立地定制。例如，在单一制剂中，具有大的孔入口开口的二氧化硅囊泡可 用于装载大分子例如蛋白质，而相同制剂中的小有机药物分子可容纳在具有较小孔入口开 口的二氧化硅囊泡内以更好地进行这些小分子的受控释放，如果需要的话。作为另一个例 子，多价疫苗制剂可使用疏水修饰的二氧化硅囊泡构建以最大化具有强疏水性特征的蛋白 免疫原的装载，而未修饰的囊泡可用于在相同制剂中容纳更亲水性的免疫原。作为构建组 合产品的替代策略，二氧化硅囊泡可以用不同的活性分子相继装载。
[0152] 在一个实施方案中，免疫原性组合物包括多个具有基本上相同特征的二氧化硅囊 泡，其呈递或包封多个具有彼此不同的结构和/或功能特性的免疫原。
[0153] 在一个实施方案中，免疫原性组合物包括多个具有不同结构特征的二氧化硅囊 泡，其呈递或包封具有基本上相同的结构和/或功能特性的免疫原。
[0154] 本领域技术人员还将理解，本发明的免疫原性组合物可以使用任何数量或组合的 赋形剂材料来配制。这些赋形剂材料可以被包括在制剂中用于任何数目的本领域技术人员 公知的原因，包括但不限于，提供稳定的制剂，改善流动性，调整pH，允许容易的重建，稳定 抗原物质，最小化不良毒理学反应，改善可制造性，增加稳定性或使用寿命或允许更容易的 管理、储存或运输。可用于配制包含本发明的免疫原性组合物的药物产品的赋形剂包括但 不限于，丙酮，醇，无水乳糖，蓖麻油，乙酸邻苯二甲酸纤维素，葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖， FD&C Yellow#6铝色淀染料，胎牛血清，人血清白蛋白，硬脂酸镁，微晶纤维素，聚维酮C，波 拉克林钾，碳酸氢钠，蔗糖，氢氧化铝，氨基酸，苄索氯铵，甲醛，无机盐和糖，维生素，天冬酰 胺，柠檬酸，乳糖，甘油，柠檬酸铁铵，硫酸镁，磷酸钾，磷酸铝，甲醛，戊二醛，2-苯氧基乙醇， 戊二醛，聚山梨醇酯80，硫酸铝钾，硫酸铵，牛提取物，明胶，蛋白胨，磷酸钠，硫柳汞，小牛血 清，戊二醛，乳清蛋白水解物，新霉素硫酸盐，多粘菌素 B，乳清蛋白水解物，酵母提取物， MRC-5细胞蛋白，新霉素，多粘菌素 B硫酸盐，羟基磷酸铝硫酸盐，氯化血红素，矿物盐，烟酰 胺腺噪呤二核苷酸，硫酸错钾，硼酸钠，大豆蛋白胨，磷酸盐缓冲剂，polsorbate 20，硼酸 钠，脂类，磷酸二氢钠脱水物，碳水化合物，L-组氨酸，β-丙内酯，氯化钙，磷酸氢二钠，鸡蛋 蛋白，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，多粘菌素 Β，氯化钾，牛磺脱氧胆酸钠，硫酸庆大霉素，氢化 可的松，辛苯昔醇l〇，a-生育酚琥珀酸氢酯，脱氧胆酸钠，卵清蛋白，壬基苯酚乙氧基化物， 辛基苯酚乙氧基化物(Triton X-100)，精氨酸，磷酸氢二钾，鸡蛋蛋白，乙二胺四乙酸，硫酸 庆大霉素，水解猪明胶，磷酸二氢钾，谷氨酸一钠，硫酸鱼精蛋白，焦亚硫酸钠，苯酚，酪蛋白 氨基酸，柠檬酸钠，磷酸二氢钠一水合物，氢氧化钠，碳酸钙，葡聚糖，山梨糖醇，海藻糖，糖 醇，多糖，葡糖胺，甘露糖醇，聚合物和黄原胶。
[0155] 优选地，免疫原是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的免疫原性片段。更优选地，免疫原是 BVDV的E2蛋白，或其片段。结构包膜糖蛋白E2是主要的免疫原决定簇，并且是作为亚单位疫 苗的理想候选物，因为用E2的免疫引起中和抗体的产生。在天然感染或疫苗接种后E2产生 的中和抗体被视为针对后续BVDV感染最重要的保护介质。优选地，在免疫原性组合物中使 用的E2蛋白是使用大肠杆菌表达产生的可溶的、无内毒素的E2。以这种方式表达的E2蛋白 已被证明在小鼠和羊中是免疫原性的并且通过几个BVDV-E2特异性抗体是可检测的。它在 本文被称为0ptiE2蛋白。
[0156] 牛病毒性腹泻(BVD)是一种常见的牛疾病，导致严重的粘膜病变和临床疾病诸如 生殖、先天缺陷和持续感染。BVDV，俗称牛瘟病毒，是一种单链RNA病毒，其主要感染牛和一 些绵羊。关于瘟病毒的主要担忧不仅限于所发生的显著的经济损失，而且在于这样的事实， 这些病毒不是宿主特异性的，表明它们能容易地在家畜例如绵羊、猪和山羊中传播。已公认 的是绵羊和山羊可感染BVDV，然后将病毒传播回到牛。BVDV还已被发现在本地野牛和水牛 群体中。
[0157] 目前，现有的活的和灭活的BVDV疫苗在防止大多数与急性感染相关的临床疾病上 是相对有效的，但是这些疫苗不能完全保护避免由持续感染的动物导致的传播。迄今为止， Pestigard? (Pfizer)是被批准在澳大利亚使用的唯一 bvdv疫苗。它是一种灭活病毒疫 苗，具有两个抗原上不同的1型BVDV株，其已在澳大利亚(Trangie和Bega)分离。这种疫苗需 要以两个剂量施用，间隔6-8周，此后需要每年加强注射。一旦打开，疫苗只有一个月的短贮 藏寿命，且需要冷冻。BVDV疫苗Bovi 1 i s BVD (Merck)，可在英国获得并且包括C-86株的灭活 BVDV抗原。它保护胎儿避免BVDV的经胎盘感染并且动物需要每年加强剂量用于保护。它在+ 2°C至+8°C有18个月的贮藏寿命。一旦打开，疫苗的贮藏寿命减少到10小时。
[0158] 亚单位疫苗包含高度纯化的重组抗原，例如蛋白和肽，这些疫苗是更稳定的，并且 比常规疫苗具有更好的安全性特征。然而，亚单位疫苗可具有不良的免疫原性，并且通常由 于代谢酶的降解而无法穿过肠粘膜组织。为了提高亚单位疫苗的免疫原性，通常加入佐剂 到制剂中。佐剂被定义为被添加到疫苗制剂中以增强树突状细胞(DC)的活化和产生强抗原 特异性免疫应答的化合物。
[0159]本发明的二氧化硅囊泡还适合于与DNA疫苗一起使用。虽然DNA疫苗能够引发强烈 的免疫应答和高特异性，但它们常常遭受低效率的体内细胞转染。由于它们通过内吞作用 有效穿透细胞壁和释放生物活性有效载荷的能力，本发明的免疫原性组合物还可用于开发 具有高转染效率的有效DNA疫苗。
[0160] 基于QuilA皂苷的佐剂已知刺激Thl细胞免疫应答和针对抗原的细胞毒性T淋巴细 胞的产生，使其理想用于针对传染性疾病和癌症免疫治疗的亚单位疫苗。然而，缺点例如注 射部位的疼痛、严重的局部反应和这些佐剂的毒性特征使得它们不适于人类使用。
[0161] 在实验部分中使用本发明的中空二氧化硅囊泡SV-10-x_140(是未经修饰的二氧 化硅囊泡）和SV-lO-x-lOO-A(是氨基修饰的二氧化硅囊泡）来测试对MDBK细胞的体外细胞 毒性作为测试它们用作纳米疫苗制剂中的递送剂的前序。在细胞培养研究中发现〇.5mg/ml 浓度的氨基官能化的SV-lO-x-lOO-A相较于未官能化的SV-10-x-140(图18)是具有毒性的。 然而，0 · lmg/ml和0 · 01mg/ml的较低浓度的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A均是低毒性的。因 此，基于体外细胞毒性结果，SV-lO-x-140和SV-10-x-lOO-A均被选择用于进一步研究。 0ptiE2蛋白装载的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A的浓度在过夜吸附后为200yg蛋白/mg二 氧化硅囊泡，如通过蛋白测定法测定的。这代表了抗原组分的优异装载水平并且是本发明 的中空二氧化硅囊泡的有利特征。
[0162] 在37°C下对不同缓冲液中的0ptiE2装载的SV的体外脱附研究表明一旦结合至本 发明的SV，蛋白不容易解离，这是进一步有利的。当用0.1N HCL和柠檬酸盐缓冲液pH 4.0进 行实验时，OptiE2蛋白没有解离，然而，在0.1 %SLS中发生蛋白的最小脱附。
[0163] 为了测定未官能化和氨基官能化的囊泡所需的最佳特性诸如孔径、表面积和官能 化，两种囊泡在体内动物研究中进行了研究。用0ptiE2(50yg)装载的SV-10-x-140(250yg) 和0ptiE2(50yg)装载的SV-10-x-100-A(250yg)免疫原性组合物注射的处理组诱导优秀的 抗体应答，这与用Opt iE2 (50yg) +Qui 1 A(10yg)施用的阳性对照组是相当的。然而，传统的 佐剂Quil A的共施用没有增强总IgG滴度和针对0ptiE2的IFN- γ应答，因为用Quil A+HSV 纳米疫苗注射的处理组看起来类似于阳性对照组和0ptiE2蛋白装载的HSV组。佐剂类似于 免疫刺激剂或作为抗原运载媒介物发挥作用，Quil A已知引发T细胞介导的免疫应答并且 本发明人已经证明，二氧化硅囊泡具有诱导抗体和T细胞介导的应答的能力。佐剂和纳米颗 粒的共施用将引起强烈的免疫应答的假设基于抗原的免疫刺激作用和"贮库效应"缓慢释 放，其中Quil A会增强免疫应答并且抗原装载的纳米颗粒会用作递送媒介物和免疫刺激 剂。然而，从这个实验中得到的结果表明，二氧化硅HSV与传统佐剂Quil A的共同施用不引 起强健的免疫应答。
[0164] 这突出显示了本发明的二氧化硅囊泡的佐剂性质，因为它们充当优良的免疫刺激 剂以及抗原递送载体，施用蛋白加 SV纳米制剂的小组相较于阳性对照组诱导针对0ptiE2表 位的较好的IFN-γ应答。抗原装载的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A引起良好抗体和细胞介 导的免疫应答。小鼠在整个实验中保持健康，并且在注射部位没有明显的局部应答。传统佐 剂Quil A至蛋白/纳米颗粒制剂的添加没有增强免疫应答。这表明，SV本身充当优良佐剂并 因此当用作纳米疫苗或免疫原性组合物的一部分时呈现许多优点。
[0165] 优良的结合性质、低毒性、相对高的细胞摄取水平和孔壁结构导致作为免疫原性 组合物的一部分具有高度有利的性质的HSV。这些性质，特别是与HSV的大的内部腔组合的 孔壁结构，使此递送系统特别适合用于单剂量疫苗产品的开发和制造。更具体地，HSV的大 的内部腔允许大量的药物被装载到HSV中和大于正常剂量的药物被递送至患者或受试者。 由于HSV的孔壁结构提供药物从HSV的有限释放速率，这种大剂量不会立即全部成为生物可 利用的，从而防止过量的发生。相反，药物被释放缓慢，以使得可以在延长的时间段引发免 疫应答。以这种方式，使用多剂量方案(例如初免-加强方案)常规递送的药物可通过使用在 如本文所述的制剂中的HSV被开发为单剂量药物。药物的给药方案从多剂量到单剂量的转 化具有许多优点，包括较低的管理成本和潜在的较高遵从性，因为以多剂量递送的一些药 物的现实世界效力受到对多剂量方案的不良遵从的限制。
[0166] 此外，疫苗免疫原/抗原和更一般地蛋白长期以来遭受不佳的热稳定性，从而需要 从生产位置到使用地点的冷藏（即"冷藏链"）以避免疫苗抗原或蛋白的降解和性能降低。在 药物研究中的一个主要目标是提高热稳定性，因为这将极大地改善可用性并降低疫苗和蛋 白疗法的成本，特别是在偏远地区例如一些农场和发展中国家。本发明人已经发现，包含在 本发明的二氧化硅囊泡内的蛋白具有显著改善的热稳定性，以使得收容在二氧化硅囊泡内 的蛋白可暴露于比室温高不少的温度而不显著变性蛋白和影响其生物活性。可以暴露于升 高的温度，而二氧化硅囊泡/蛋白系统是在液体载体中或为干燥粉末的形式。后者是可能 的，因为如果需要，含蛋白的二氧化硅囊泡可以被干燥并重构(重悬浮)在液体载体中。
[0167] 本发明人还发现，在本发明的二氧化硅囊泡内包封蛋白改善了蛋白对酸导致的分 解的抗性。这对于其中二氧化硅囊泡可用于通过口服递送途径递送蛋白或其它酸敏感性分 子的情况是特别有用的特性。蛋白难以通过口服途径递送，因为由于高酸性环境它们在胃 中通常被分解，使得它们较不药学上有效。本发明人令人惊讶地发现，包含在二氧化硅囊泡 内的蛋白在暴露于模拟胃的环境的酸性条件时不显著变性。因此，当酸敏感分子例如蛋白 需要被递送时，可行的是将二氧化硅囊泡用于开发口服剂型。也提供了针对胰蛋白酶和其 他消化剂的类似的保护。
[0168] 本发明的第六方面在于在受试者中引发免疫应答的方法，其包括施用治疗有效量 的第五方面的免疫原性组合物的步骤。
[0169] 应当理解的是，本发明的免疫原性组合物不限于它被用来预防（在预防性疫苗的 情况下）或治疗(在用于治疗的疫苗的情况下）的疾病的类型。可能通过使用本发明的免疫 原性组合物治疗或预防的疾病的实例包括，但不限于，腺病毒4型和7型，炭疽，结核，白喉和 破伤风，百日咳，乙型肝炎，脊髓灰质炎病毒，嗜血菌属，脑膜炎球菌病，甲型肝炎，人乳头瘤 病毒，流感，日本脑炎，麻疹，腮腺炎和风疹，肺炎球菌病，狂犬病，轮状病毒，天花，伤寒，水 痘和黄热病。
[0170] 免疫应答可以是细胞介导的免疫应答或抗体免疫应答。
[0171] 本发明的第七方面在于在受试者中预防或治疗疾病或病况的方法，其包括施用治 疗有效量的第五方面的免疫原性组合物的步骤。
[0172] 在一个实施方案中，疾病或病况可以是牛病毒性腹泻，牛流行热，无形体病，人乳 头瘤病毒(HPV)，乙型肝炎病毒和流感以及在上文第五和第六方面相关列出的那些疾病或 病况。
[0173] 如本文中所使用的，术语"受试者"或"个体"或"患者"可指对于其治疗或预防是期 望的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别地哺乳动物或鱼受试者。合适的脊椎 动物包括但不限于，灵长类动物，鸟类，家畜动物(例如，绵羊，牛，马，驴，猪，鱼），实验室试 验动物(例如，兔，小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠），伴侣动物(如猫，狗)和捕获的野生动物(如狐狸， 鹿，澳洲野狗）。优选的受试者是选自牛、绵羊、猪、鱼或山羊的家畜动物。
[0174] 本发明的第八方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡以及免疫原在制备用于 治疗疾病或病况的药物中的用途。
[0175] 疾病或病况可以是上文关于本发明的第五至第七方面中描述那些中疾病或的任 何一个或多个。
[0176] 本发明的第九方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡用作佐剂的用途。
[0177] 第六、第七、第八和第九方面的所有组分包括免疫原、二氧化硅囊泡、用于治疗的 疾病或病况等可以是如第一至第五方面的任一方面中所描述的。
[0178] 如以上所讨论的，已实验证明，通过本文描述的方法合成的二氧化硅囊泡用作优 良的免疫刺激剂以及抗原递送载体。在SV的存在下已显示出改善的针对0ptiE2表位的IFN-γ应答。
[0179] 实验
[0180] 材料
[0181] 嵌段共聚物Ε039Β〇47Ε039，商业名称Β50-6600，[Ε0是聚（氧化乙烯），Β0是聚(氧化丁 烯）]从Dow公司购买。原硅酸四乙酯(TE0S，彡98 % )，（ 3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)和 荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)均购自Sigma-Aldrich。其它试剂均为分析试剂级的。
[0182]
[0183] 利用在1.5kV运行的JEOL JSM 7800F场发射扫描电子显微镜（FE-SEM)观察HSV的 形态。为了FE-SEM测量，通过在乙醇中分散粉末样品来制备样品，之后将其滴到铝箱片上并 附着至SEM支架上的导电性碳膜。
[0184] 透射电子显微镜(TEM)图像用分别在200kV和100kV运行的JE0L 2100和JE0L 1010 获得。为了 TEM测量，通过在Cu网格上的碳膜上于乙醇中分散粉末样品并干燥来制备样品。 [0185] 氮吸附/脱附等温线使用Micromeritics Tristar II系统在77K测量。将样品在 453K于真空管线上脱气过夜。孔体积和腔尺寸分布曲线衍生自使用Broekhoff和de Boer (BdB)模型的等温线吸附分支。Barrett-Joyner-Halanda(BJH)方法被用来计算来自脱附分 支的入口尺寸，并且Brunauer-Emme tt - Te 11 er (BET)方法被用来计算比表面积。总孔体积从 在0.99的最大相对压力(P/Ρο)上吸附的量来计算。
[0186] 傅立叶变换红外（FTIR)光谱在配备有Diamond ATR(衰减全反射）晶体的 ThermoNicolet Nexus 6700 FTIR光谱仪上收集。对于每个光谱，在4CHT1的分辨率在范围 400-40000^1上收集32个扫描。
[0187] 反应混合物的低温-TEM和ATR-FTIR在不同的反应时间进行，以使得能够实时监控 二氧化硅囊泡的形成。对于低温-TEM样品制备，添加 TE0S到含有嵌段共聚物的缓冲液之前 和之后，将一滴的反应混合物滴到Cu TEM网格上的碳膜上，随后在15小时和24小时分析样 品。用液氮处理TEM网格10分钟，然后冷冻干燥至少2天。
[0188] 对于ATR-FTIR研究，在步骤1中的加入TE0S到缓冲溶液后不同的反应时间（3，6，9， 12，15和24小时)收集一系列的411?41'11?光谱。针对使用具有等量似 25〇4的相同缓冲溶液测 量的背景获得各光谱。在步骤2中对于反应混合物进行进一步的两个分析，其在70°C进行。 分析分别在3和6小时进行。
[0189] 中空二氧化硅囊泡的制备
[0190] 步骤1:0 · 5g EO39BO47EO39被溶解于30g的pH = 4 · 7NaAc-HAc缓冲液（[NaAc] = [HAc] =0.40M)，在10°C下在搅拌下加入0.852g Na2S〇4(0.20M)，以形成均匀的溶液。向此溶液加 入3.33g TE0S，在连续搅拌下持续24小时。
[0191] 为了研究步骤1中温度的影响，在20°C进行第二实验，所有其它参数保持相同。
[0192] 进行进一步的实验以研究步骤1中搅拌的影响，所有其它参数保持相同，但只进行 10分钟的搅拌，随后将反应混合物在静态条件下静置24小时。在无搅拌的情况下出现的反 应混合物的不同相将被分离到不同的容器中以进行后续步骤。
[0193] 步骤2:在步骤2中，将来自步骤1的反应混合物升温至中等温度(40，50，60或70°C 均在单独的实验中试验)并持续搅拌另外24小时。
[0194] 步骤3:将来自步骤2的反应混合物分别暴露在不同温度下的水热处理(HT)。为了 实现此，将合适的样品从它们的反应容器取出并放入高压灭菌器并在100、120、130、140、 150、170或180°(：之一下分别以1、2、2.5、3.5、5、8和10巴的压力水热处理进行另外24小时。 该处理步骤后，将沉淀物滤出，用水反复洗涤以除去添加的盐，并随后在空气中干燥(在本 文被称为"合成的样品"）。由合成的样品在550Γ在空气中煅烧5小时得到最终产物。为了指 示在步骤2之后中空二氧化硅囊泡的可用性，将若干这些样品滤出沉淀物、洗涤并煅烧准备 用于分析而不经受步骤3。
[0195] HSV的氨基和FITC修饰
[0196] 在HSV氨基修饰过程中，将1.5g经煅烧的SV-10-50和SV-10-50-140加入到单独的 烧瓶中。将60ml甲苯加入到每个烧瓶中，将反应物在加入1.0ml APTES之前搅拌6h。在110°C 搅拌12小时后，将HSV用甲苯和乙醇充分洗涤随后在室温下在通风橱中干燥。氨基修饰的样 品相应地用 SV-10-50-A 或 SV-10-50-140-A 表示。
[0197] 为了用FITC修饰HSV，将游离的-NH2部分用于以FITC标记。FITC的官能团硫氰酸酯 是高度氨基反应性的。将20mg粉状SV-A即氨基修饰的二氧化硅囊泡分散在3ml去离子水中 并混合5ml的FITC乙醇溶液(0.3mg/ml)。在室温下在黑暗中搅拌6小时后，将SV离心并用乙 醇洗涤三次直至上清液变为无色。在SCC25细胞摄取实验中使用之后将FITC标记的SV用于 共聚焦显微镜观察。
[0198] HSV的疏水性修饰
[0199] 为了实现SV的疏水性修饰，将48mg经煅烧的SV-10-50和SV-10-50-140分别加入两 个50ml三颈烧瓶中。各样品置于6ml甲苯中并将反应混合物搅拌6小时随后加入0.12ml(2% v/v)正-十八烷基三甲氧基硅烷(n-〇DMS)。在110 °C搅拌12小时后，将疏水性修饰的SV用甲 苯和乙醇充分洗涤随后在室温下在通风橱中干燥。疏水性修饰的SV产物相应地表示为SV-10-50-C18或SV-10-50-140-C18。
[0200] 细胞培养和吸收
[0201] SCC25细胞在5 %⑶2 37°C下保持在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中并补充有 胎牛血清（10%，Sigma，M0)、L-谷氨酰胺（1 % )、青霉素（1 % )和链霉素（1 % )。将培养基于隔 日常规更换并将细胞在达到汇合之前通过胰蛋白酶消化分离。SCC25细胞在6孔板中接种于 玻璃盖玻片（5xl05细胞/孔)并温育24小时。在用PBS洗涤两次后，将细胞用2ml补充血清的 DMEM培养基中的lug/ml FITC标记的SV-10-50或SV-10-50-140温育24小时。随后，将细胞用 PBS洗涤两次以除去剩余的SV和死细胞。然后将细胞在4°C下用2ml 4%PFA溶液固定30分 钟，它们的细胞核用DAPI染色，并安装在玻璃载玻片上。最后，将细胞共聚焦显微镜（LSM Zeiss 710)下观察并捕获图像。
[0202] 细胞色素 c的装载和染色
[0203] 将含有lmg的煅烧后或氨基修饰后的SV-10-50或SV-10-50-140的0·5ml PBS溶液 与0.5ml细胞色素 c-PBS溶液(2mg/ml)混合。在25°C温育不同的时间范围后(5、15、30分钟， 1、2、3、8和12小时），将混合物离心。为了评估细胞色素 c的装载效率，收集上清液并在480nm 的波长使用UV-2450(UV-Vis分光光度计，Shimadzu)测量残留的细胞色素c含量。细胞色素c 的装载量可以基于原始和残余的细胞色素 c的浓度和体积来计算。细胞色素 c装载的SV被重 新分散到lml中。此悬浮液的一滴可以滴到Cu TEM网格上的碳膜上并在空气中干燥。然后在 60 °C用在50 %乙醇溶液中的染色剂5 %乙酸双氧铀(UAT)处理TEM网格6分钟。经染色的TEM 网格用去离子水洗涤并在空气中干燥。
[0204] 核糖核酸酶A的装载和染色
[0205] 将含有 lmg的 SV-10-50-C18 或SV-10-50-140-C18 的0.5ml 磷酸缓冲盐水(PBS)溶液 使用超声波浴制备为悬浮液。各悬浮液与〇.5ml核糖核酸酶A(RNA酶A)-PBS溶液(2mg/ml)混 合。在25 °C的培养箱中以200rpm摇动18小时后，将混合物离心。为了评估RNA酶A装载效率， 将上清液通过200nm的过滤器收集，残余的RNA酶A含量在277.5nm波长使用UV-2450(UV-Vis 分光光度计，Shimadzu)测量。RNA酶A的装载量可以基于原始和残余的RNA酶A浓度和体积来 计算。RNA酶A装载的SV被重新分散到lml中。此悬浮液的一滴可以滴到Cu TEM网格上的碳膜 上并在空气中干燥。然后在60°C用在50%乙醇溶液中的染色剂5%乙酸双氧铀（UAT)处理 TEM网格6分钟。经染色的TEM网格用去离子水洗涤并在空气中干燥。
[0206] 细胞毒性和RNA酶A变性
[0207] SCC25细胞以2xl04细胞/孔的密度接种在96孔板中并在37°C下在5%C0 2中培养24 小时。然后，将游离的RNA酶A、SV、RNA酶A装载的SV和对应的变性样品以4-16μg/ml的RNA酶A 剂量加入到DMEM培养基中的细胞，将细胞在37 °C下在5 % C02中温育24和72h。接着，将MTT试 剂(来自roS中5mg/ml溶液的10μ1/孔体积)加入到各孔，振荡10秒，然后在37 °C温育4小时。 对于上述细胞毒性实验在离心后在除去上清液后收集沉淀。然后将DMSO(lOOyl)加入到每 个孔中，以溶解甲臜晶体，光密度(0D)用微板读数器(SpectraMax M5,Bio-Strategy，Ltd) 在570nm下记录。在不存在SV和RNA酶A的情况下温育的细胞用作为对照。所有实验以一式三 份对各组进行。
[0208] 另一系列对照组在RNA酶A的热和酸变性后制备，包括游离的RNA酶A和RNA酶A装载 的SV。在变性过程中，将50μ1 !1(：1(0.0謂，？!12.0)溶液加入到111^游离1?熟酶4或6-911^的3￥ (装载有lmg RNA酶Α)。混合物在65°C温育40分钟，冷却并离心。将NaOH(O.OlM)溶液逐滴添 加到该混合物中，直到pH达到~7,通过精确pH试纸指示并用作本实验的变性RNA酶A组。
[0209] 中空二氧化娃囊泡作为疫苗递送系统
[0210] HSV 特征
[0211] 在"纳米疫苗"实验中使用的SV是具有如下面的表1中所示的特征的未修饰的"SV-ΙΟ-χ-140" 和氨基修饰的 "SV-10-X-100-A"。
[0212] 表l:SV-10-x-140 和 SV-10-X-100-A 的特征
[0215] 用于体外细胞毒性测定的台盼蓝染色
[0216] 将Madin-Darby牛肾（MDBK)细胞(ATCC)以80-90%汇合在24孔板中接种到盖玻片 上，并允许在37°C，5%C02培养箱中贴壁过夜。为了研究纳米颗粒浓度对细胞的效果，制备 在Earle最小必需培养基（含有5%胎牛血清（Life Technologies))中的一定稀释范围 (0 · 5mg/ml，0 · lmg/ml和0 ·01mg/ml)的SV-10-X-140和SV-ΙΟ-χ-ΙΟΟ-Α颗粒并轻轻逐滴加至 贴壁细胞。将细胞在未官能化的合成的纳米颗粒SV-10-x-140、SV-10-x-100-A和MCM-41(可 商购的介孔二氧化硅）的存在下在37°(：，5%〇) 2温育20小时。小心去除培养基，用PBS轻轻洗 涤孔三次以除去SV/纳米颗粒。为了测定细胞存活性，将0.2 %台盼蓝染色剂（Life Technologies)加入进行2分钟。将台盼蓝染色剂小心去除并用PBS洗涤孔一次。将细胞固定 在4 %多聚甲醛(PFA)pH 7.4中进行15分钟，然后用roS洗涤三次。盖玻片用5μ1的M0WI0L (Sigma)安装。细胞存活性通过用Zeiss HAL100显微镜在亮视野下成像来测定。
[0217] 0ptiE2吸附至SV和SV-A纳米颗粒
[0218] 吸附反应使用在2ml最终体积中2.5mg/ml的无菌Tris缓冲液中的1.5mg具有300yg 0ptiE2的SV-lO-x-140和SV-ΙΟ-χ-ΙΟΟ-Α颗粒。该颗粒-蛋白浆液放置在室温(RT)的摇床上， 24小时后移出颗粒-蛋白浆液的样品（50μ1)，并在16.2g下离心1分钟。未结合的0ptiE2蛋白 的量通过在SDS-PAGE凝胶上的上清液的电泳评估。
[0219] 脱附研究
[0220] 0ptiE2装载的SV-lO-x-140和SV-ΙΟ-χ-ΙΟΟ-Α纳米颗粒沉淀物重悬浮于1000μ1的 PBS加0.1 % SLS(月桂基醚硫酸钠)或0.1 N HCL或pH为4.0的柠檬酸盐缓冲液中，并将样品在 室温下以200rpm留在摇床上进行120分钟。上清液通过在SDS-PAGE凝胶上的电泳评估脱附 的蛋白。
[0221] 蛋白测定
[0222] 吸附样品的上清液按照制造商的说明通过蛋白测定法(BioRad DC试剂盒)定量。
[0223] 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
[0224] 将二氧化硅囊泡/纳米颗粒样品重悬浮在15μ1 PBS和5μ1 SRB(SDS还原缓冲液，由 62.5111]\11^8-!1(：1(口!1为6.8)，117111101'1'，10%甘油，2%505,0.02%溴酚蓝组成）中，在85 1€ 下温育2分钟，然后在10%的1'1^8-甘氨酸凝胶（1]1￥；[1：1'(^611)上进行电泳。凝胶通过在50% 甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯蓝R250中染色30分钟，随后在30%甲醇，10%乙酸中进行三 次30分钟洗涤进行脱色来可视化。
[0225] 在小鼠中进行的免疫研究
[0226] C57BL/6J小鼠购自且在无特定病原体条件下饲养于Biological Resource Facility,The University of Queensland,Brisbane,Australia。八周大的雌性小鼠以每 组4只动物在环境控制的区域以12小时白天和12小时黑暗的循环饲养在HEPA过滤的笼中。 自由取用食物和水。所有的程序由University of Queensland Ethics Committee批准。动 物在整个研究中密切监测。所有的动物在研究过程中保持良好的健康且无可见的有害健康 的影响。免疫前血液样品通过使用肝素涂覆的血细胞比容管(HirschmannLaborgerSte，： Heilbronn，Germany)的眼眶后出血收集。在首次免疫之前收集的免疫前血液样品被称为免 疫前(PI)样品。下面的表2显示了研究中的不同处理组。如上所述在无菌条件下制备吸附反 应物。将QuilA(Superfos Biosector，Vedback,Denmark)以2mg/ml重悬浮在无菌注射用水 (Pfizer, Brooklyn , USA)中。可注射的剂量通过四次皮下注射施用至尾基部以研究通过 0ptiE2 装载的 SV-10-x-140、0ptiE2 装载的 SV-10-x-140+QuilA、0ptiE2 装载的 SV-10-x-100-A和0ptiE2装载的SV-10-X-100-A+QuilA产生的免疫应答之间的差异。小鼠的阳性对照 组接受50yg 0ptiE2蛋白和 10yg QuilA。阴性对照组接受SV-lO-x-140和SV-10-X-100-A (250yg)囊泡+Quil A(10yg)的注射。100μ1的剂量体积(在0.9%盐水中，Pfizer)通过使用 无菌27号针头(Terumo, Tokyo, Japan)在尾基部皮下注射施用。三次注射以2周间隔向所有 的处理组施用，除未免疫组以外；在最终免疫后14天处死小鼠。使用酶联免疫吸附测定 (ELISA)研究0ptiE2特异性抗体应答和使用ELIS0PT测定研究细胞介导的应答。
[0227] 表2:小鼠试验中的免疫组。所有剂量在尾基部施用。
[0229] ELISA 方案
[0230] 0ptiE2特异性抗体应答的检测：用于检测0ptiE2特异性抗体的酶联免疫吸附测定 (ELISA)通过用PBS中的0ptiE2抗原溶液(2ngyL-l，50yL)在4°C对微量滴定板(96孔，Nunc， Maxisorb，Roskilde，Denmark)涂覆过夜来进行。除去涂覆溶液，将板用PBS-T(PBS(1 X )， Tween_20(0 · 1 % )，Sigma-Aldrich)洗涤一次，并用PBS(200yL)中的牛血清白蛋白（BSA， 5%，Sigma-Aldrich)和脱脂乳（5%，Fonterra,Auckland,New Zealand)在RT轻轻摇动封闭 1小时。板用PBS-T洗涤三次。小鼠血清样品在roS( 50yL)中从1:100稀释至1:6400，将各稀释 液加入到经封闭的板的孔中随后在室温下温育2小时。为了检测小鼠抗体，将在PBS中稀释 至1:1000的HRP缀合的多克隆绵羊抗小鼠 IgG抗体(Chemicon Australia，Melbourne，VIC, Australia)加入到每个孔中，并在室温下轻轻摇动温育1小时。将板在roS-T中洗涤三次。将 TMB底物（100yL，Sigma-Aldrich)加入到每个孔中，并在室温下温育15分钟;将HCl(lN，100y L)加入到孔中以停止生色反应。在Labsystems Multiskan RC板扫描仪上以450nm读板。
[0231] 鼠脾细胞的分离和ELISP0T测定
[0232] 在安乐死后无菌取出脾脏并置于补充有胎牛血清（FBS，10% )、Hepes(20mM，pH 7.3)、丙酮酸钠（1M)、Glutamax(lM)、青霉素 G、链霉素、两性霉素 B(计算各自的最终量)的冰 冷的DMEM培养基(5mL)中。将脾脏轻轻破碎，并使用注射器柱塞通过尼龙网（100mm，Be Ct〇n Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。细胞用DMEM(5mL)洗涤并离心（800g，5min，4°C )，然后重 悬浮于裂解缓冲液(NH4C1(0.15M)，KHC03(10mM)，Na2-EDTA(0.1 mM)，lmL)中，在室温下 5 分 钟。重复两次洗涤步骤，每次用DMEM(9mL和5mL)。细胞沉淀重悬浮于DMEM(2mL)中并且细胞 数目通过用台盼蓝(0.2%)染色来测定。来自每只小鼠脾脏的细胞以1.0-1.5xl0 5细胞/孔 一式三份接种在用单克隆干扰素-g(IFN- γ )(Mabtech)捕获抗体预涂覆的聚偏二氟乙稀 (PVDF)ELISPOT板中。细胞在完全DMEM培养基中在37°C和5%⑶ 2在0ptiE2抗原（lmg/mL， SIINFEKL，Auspep，Parkvi lie，VIC, Australia)或作为阳性对照的多克隆活化剂伴刀豆球 蛋白A( Con A，lmg/mL, Sigma Aldrich)的存在或不存在下温育40小时。IFN- γ ELI SPOT测定 根据制造商的说明书进行。ELISPOT平板在ELISPOT读数仪（Autoimmun Diagnostika， Strassburg，Germany)上读取。
[0233] 莖里
[0234] SV的特征
[0235] 图1显示了两个场发射SEM图像(A和B)，显示SV-10-50(图像A)和SV-10-50-140(图 像B)均具有低于100nm的均匀粒度的球形形态。在图2中，合成的SV-10-X-100的TEM图像显 示具有约50nm直径和约5nm壁厚度的单层囊泡（图2A)。从更高的放大倍率的TEM图像（图 2B)，可以看出，在囊泡壁中形成二氧化硅-空隙-二氧化硅的夹心样单层结构，表明如在图3 中所示的二氧化硅-表面活性剂复合物的存在。在煅烧后，SV-10-50保持单层囊泡结构，如 图4A中所示的，并且球形体可以在囊泡壁内部清楚地观察到，表明二氧化硅囊泡具有由这 些球形体构成的囊泡壁结构，为在硅质壁中的气泡状空隙，其可以是彼此分开的或者可以 相互连接以形成从外部到SV的内部腔的通路。这在图4B中清楚地看到。SV-10-50-140也保 持单层囊泡结构（图4C)，并且约15nm的入口尺寸可以在壁上观察到，如图4D中所示的。
[0236] 在二氧化硅囊泡壁中空隙的存在通过犯吸附分析进一步证实。图5A显示了在步骤 (b)中的40-70°C的热处理的SV样品的氮吸附-脱附等温线，其均显示具有H2型滞后回线的 IV型等温线，表明已被暴露于第二步骤中的"中间"温度处理的这四个样本显示出类似的孔 结构。来自N2吸附结果的更多结构信息示于表1中。图5B显示了已被暴露于2、2.5、3.5、5、8 和10巴压力下的120、130、140、150、170和180 °C的水热处理温度的SV样品的氮吸附等温线， 这些被发现是典型的IV型等温线，其中随着水热处理温度的升高脱附分支迀移至较高的相 对压力。BdB方法被用来从氮吸附等温线的吸附分支计算腔尺寸，并且入口尺寸使用BJH法 从脱附分支计算。图5C中的BdB孔径分布曲线显示以40-70Γ进行的步骤(b)的SV样品中以 约2和15nm为中心的峰，并且对于经受1-10巴压力下100-180 °C的水热处理温度的SV样品， 如图5D中所示，从脱附分支计算的BJH孔径分布曲线显示峰随着温度的升高迀移至右边，这 表明增加的入口尺寸。
[0237] 值得注意的是，所有的SV样品显示40-50nm的BdB计算的内腔尺寸（图6)，这表明所 有的SV样品具有在此范围内的类似腔尺寸。如总结于下表3中的，SV的孔入口尺寸可以在6-16nm的范围内进行调整。
[0238] 表3:来自N2吸附结果的结构信息
[0239]
[0240] X:在10°C下连续搅拌后进行直接水热处理的样品。VP:总的孔体积；SBET: BET表面 积。
[0241] 煅烧后的SV-10-70的TEM图像（图7A)显示具有符合已对SV-10-50所观察的孔壁结 构的类似的囊泡结构。相反，在煅烧之后的SV-10-x-100、SV-10-x-130和SV-x-180的TEM图 像(图7B-D)中没有观察到孔壁结构，表明中等或中间温度的第二处理步骤对于适当的孔壁 结构形成是必不可少的。具有约10和30nm的尺寸的孔入口也可分别观察到（图7C和D)，这是 符合N 2吸附结果的。
[0242] 相比较而言，仅用10分钟搅拌随后24小时静态处理产生的SV样品的TEM图像显示 没有囊泡结构。相反，分别如图8A和B中显示的，观察到短的管状结构和无定形二氧化硅结 构。相较于在连续搅拌下实现的均匀白色反应混合物，如图8C中所示，不进行连续搅拌的反 应混合物分离成透明下层相和白色凝胶状上层相，如图8D中所示。SV-20-X-100的TEM图像 显示囊泡和管状结构的混合物，图8E。从这个结果清楚的是，某种形式的搅拌对于形成所需 囊泡形态是至关重要的。
[0243] 低温-TEM和ATR-FTIR观察结果
[0244]为了理解SV形成机制，低温-TEM被用于研究在步骤(a)(图3中的T1)期间不同时间 点形成的囊泡结构。如图9A中所示，在添加二氧化硅源(TE0S)前，嵌段共聚物B50-6600表面 活性剂是直径小于20nm的胶束形式。这表明在12小时没有预成形的囊泡模板在合成中使用 (图9B)，并且SV的形成是表面活性剂和二氧化硅低聚物的协作自组装。加入TE0S后15小时 后，自组装的二氧化硅-表面活性剂囊泡可以被观察到（图9C)，但是，没有孔壁结构可在步 骤1的结束时被观察到（图9D)。因此显而易见的是，孔壁结构仅在中等温度下的后续处理中 形成。
[0245] 除了上面所讨论的低温TEM，ATR_FTIR光谱也被用于监测反应混合物中形成的化 学物质。如图3所示的，对步骤(a)或T1的不同反应时间（3，6，9，12，15和24小时）的反应混合 物的ATR-FTIR光谱进行了测量。图10A显示了出现在877、1045和1272〇11_ 1的三个特征峰，这 可以分别归因于Et0H(v(C-0)+v(C_C))和(p'（CH3)+p(CH 2))。在964CHT1观察到的弱和宽的 带与Si-ΟΗ基团的Si-Ο拉伸相关联。Si-0-Si在凝聚的二氧化硅中的振动表现出1050-WOOcnf 1区域中的宽峰，其分配是复杂的。来自步骤一的所有光谱显示在783，960(p(CH3))， 1084(v(C-0)/(C-0) + (C-C))，1105(p，（CH3))，1167(p(CH3))，1272(t(CH2))，1396(S s(CH3)) cnf1的相同特征带，其可以被分配至-S i -OCH2CH3基团。
[0246] 在如图3中所示的步骤(a)或T1中整个24小时反应期间-Si-〇CH2CH 3基团的存在显 示TE0S的水解速率是缓慢的，这可归因于烷氧基的空间位阻效应。在878和1045cnf1 (均归因 于乙醇）上条带的强度随反应时间缓慢增加，这表明TE0S的水解速率是缓慢的并且乙氧基 的水解反应在步骤(a)或T1的时间窗口中持续。值得注意的是，来源于乙氧基的水解的硅醇 基团也应显示约960CHT 1的特征带(Si-Ο拉伸）。但是，考虑到释放的乙醇的量有限和因而产 生少量硅醇，硅醇的峰可以与与SiOCH 2CH3相关联的带重叠，因此可能不被观察到。此外，通 过比较在1050-12000^ 1范围内的特征峰，在TE0S系统中没有观察到此区域中的明显的带变 宽（指示-Si-0-Si的形成），即TE0S的缩合速率也很慢。因此，在步骤(a)或Τ1中占主导地位 的硅质物质均为部分水解的硅醇和未反应的疏水乙氧基。在步骤(a)或T1中的疏水性二氧 化硅低聚物导致二氧化硅/表面活性剂复合物的高g因子。囊泡的形成被假定为来自复合层 的弯曲和闭合，这类似于表面活性剂囊泡的形成。
[0247] 在如图3中所示的步骤(b)或T2中3和6小时的反应产物的ATR-FTIR光谱也进行了 测量并显示于图10B中。所有特征峰(876，1045，1086，1277，1348，1413和1452cm-〇可分别归 因于Et0H(v(C-0)+v(C_C))和(p'（CH 3)+p(CH2))。没有峰可以被分配至-Si-0CH2CH3基团，表 明TE0S在这个步骤中具有快得多的水解速度，和在二氧化硅囊泡-表面活性剂复合物内在 步骤(b)中从-Si -0CH2CH3基团至硅醇在中等温度下的低凝缩率。在步骤(b)中的该疏水性二 氧化硅低聚物导致二氧化硅/表面活性剂复合物的低g因子，这产生二氧化硅/表面活性剂 复合物的高弯曲变化而不改变囊泡骨架以在硅质壁内形成孔壁结构。这些二氧化硅囊泡的 所提出的形成机制在图3中描述。
[0248] 细胞色素 c的装载和染色
[0249] 图11显示在测试的中空二氧化硅囊泡中第5分钟的细胞色素 c的高吸附量，这表明 煅烧后SV-10-50和SV-10-50-140的非常快速的吸附。吸附水平在5分钟后保持相对稳定，表 明已在该短时间段达到最大吸附量。装载的细胞色素 C的量对于SV-10-50、SV-10-50-140分 别为620、642mg/g。
[0250] 50 %乙醇溶液中的5 % UAT被用作针对HSV中装载的细胞色素 c的染色剂。相同的染 色方法适用于作为对照的纯SV-10-50-140-C(即煅烧后），图12A中所示的TEM图像与没有染 色的HSV的图像是相似的，表明硅质材料不会被UAT染色。图12B显示了具有较高对比度的腔 (较暗的腔，由白色箭头指示）的几个二氧化硅囊泡，所述腔是染色的细胞色素 c。腔的高对 比度随着高倾斜角保持平均，如图12C和D中所见的，这表明细胞色素 c是由HSV均匀吸附的。 此染色方法也适用于SV-10-50囊泡（图13)。
[0251] 核糖核酸酶A的装载和染色
[0252] 图14中所见的FTIR光谱显示在疏水性修饰后囊泡上十八烷基的特征峰，表明疏水 性基团成功移植到二氧化硅囊泡上。对于SV-10-50和SV-10-50-140在疏水性修饰后在18小 时的RNA酶A的吸附量分别是206 ± 6和276 ± 8mg/g。50 %乙醇溶液中的5 % UAT被用作针对SV 中装载的细胞色素 c的染色剂。相同的染色方法适用于疏水性修饰后的纯SV-10-50,并且 TEM图像（图15)与没有染色的SV的图像是相似的，表明硅质材料不会被UAT染色。图15B显示 了具有较高对比度的腔(较暗的腔）的单个二氧化硅囊泡，所述腔被认为代表染色的RNA酶 A。RNA酶A已被显示由SV均匀地吸附。
[0253] 细胞培养和摄取
[0254] 如上所述的已用FITC标记的二氧化硅囊泡通过共聚焦显微镜研究来可视化细胞 摄取。如在图16中所示，当将细胞与FITC标记的SV-10-50和SV-10-50-140温育时，源自FITC 的强绿色荧光信号在细胞内检测到，表明HSV容易被SCC25癌细胞吸收（图16H和L) AITC标 记的SV-10-50-140显示出更强的信号，表明由SCC25细胞内化的增加的量的SV-10-50-140。
[0255] 细胞毒性
[0256] RNA酶A被视为强的蛋白合成破坏剂，其可降解mRNA和tRNA来影响细胞存活性。据 报道，RNA酶A的热变性减少MCF-7细胞系中的细胞毒性，其中RNA酶A缀合在致密的二氧化硅 纳米颗粒的外表面上。游离的RNA酶A、RNA酶A装载的SV、SV和相应的变性样品的抗癌效应在 人皮肤癌SCC25细胞中进行了研究。细胞用游离的RNA酶A、RNA酶A-SV、变性RNA酶A或变性 RNA酶A-SV以相同浓度的RNA酶A进行处理。SV浓度从SV中RNA酶A的吸附量计算。
[0257] 图17中的结果表明，SV-10-50和SV-10-50-140在24小时在分别78和58μg/ml的浓 度下均显示出对SCC25细胞几乎没有毒性。SV-10-50-140显示在72小时的低毒性（17 %抑 制），这表明这两种SV种类均是生物相容的纳米载体。游离的RNA酶A和变性后的游离RNA酶A 表现出对SCC25细胞没有细胞毒性。相较于游离的RNA酶A，RNA酶A装载的SV-10-50和疏水性 修饰后的SV-10-50-140在很长一段时间范围内显示出最高的细胞毒性（分别地在24小时 17 %、26%和在72小时54%、43%的抑制）。有趣的是，相较于游离的RNA酶A，加热和强酸变 性后的RNA酶A装载的SV表现出对SCC25细胞高的细胞毒性，对于SV-10-50和SV-10-140分别 为在24小时14%、22%和在72小时48%、38%的抑制。变性后的1?嫩酶4-3￥显示比未变性的 RNA酶A-SV的略低的细胞毒性。这些结果表明，本发明的SV可以提供对RNA酶A的保护，RNA酶 A被证明吸附在二氧化硅囊泡内，从而避免恶劣的条件。RNA酶A装载的SV-10-50-140由于其 较高的细胞内化效率而表现出较高的细胞毒性。
[0258]疫苗递送系统相关结果
[0259] 体外细胞毒性研究
[0260] 对SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡的体外细胞毒性通过MDBK细胞的台盼蓝染 料排除染色来测定。将细胞用不同浓度(0.5,0.1和0.01mg/ml)的SV-10-χ-140和SV-10-χ-100 -A囊泡处理。死细胞由于染料通过透化的细胞膜的吸收而呈蓝色，而活细胞保持完整并 不吸收染料。〇.lmg/ml和0.01mg/ml的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α没有显示出对细胞存 活性的任何毒性作用（图18，b，c，e和f)。然而，0.5mg/ml的SV-lO-x-lOO-Α在20小时温育后 对MDBK细胞具有毒性作用（图18a)。用较低浓度的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡温育 的细胞看起来与无囊泡的单独温育的细胞是相当的，因此，所有进一步的实验研究使用SV-10-x-l 40 和 SV-lO-x-lOO-Α 囊泡进行。
[0261] 吸附和脱附分析
[0262] 0ptiE2蛋白装载到SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡上，如上所述。0ptiE2的分 子量为ASkDaADS-PAGE分析用于测定是否存在至颗粒的吸附。结合上清液的蛋白测定和质 量平衡方程的应用用于测定至SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡的0ptiE2吸附量。200yg OptiE2结合至lmg SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A囊泡，如通过蛋白测定法测定的。脱附研 究对 0ptiE2 装载的 SV-lO-x-140 和 SV-lO-x-lOO-Α 进行。
[0263] 为了研究脱附，将0ptiE2装载的囊泡沉淀物重悬浮于不同的缓冲液，其包括0.1N HCL、0.1 % SLS和pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液。将样品在37 °C在摇床上温育120分钟。对脱附的 上清液和颗粒级分的凝胶分析表明，在〇. IN HCL和pH 4.0柠檬酸盐缓冲液的存在下，蛋白 仍然强烈地结合至囊泡并且它没有从SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A脱附（图19)。
[0264] 图19中呈现的分析结果的详细内容如下：（a)0ptiE2装载的纳米颗粒的评估，泳道 1: 0ptiE2蛋白；泳道 2: 0ptiE2 装载的 SV-lO-x-lOO-A 上清液;泳道 3: 0ptiE2 装载的 SV-10-x-100-A-纳米颗粒沉淀;泳道4: 0ptiE2装载的SV-lO-x-140上清液;泳道5: 0ptiE2装的SV-10-x-140纳米颗粒沉淀；（b)0ptiE2装载的纳米颗粒的脱附研究，泳道1:在0.1N HCL中脱附的 0ptiE2装载的SV-lO-x-lOO-A上清液;泳道2:在0 · IN HCL中脱附的0ptiE2装载的SV-10-x-100-A纳米颗粒沉淀;泳道3:在0.1 % SLS中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-lOO-A上清液;泳 道4:在0.1 % SLS中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-lOO-A纳米颗粒沉淀;泳道5:在柠檬酸盐 缓冲液(pH-4.0)中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-lOO-A上清液;泳道6:在柠檬酸盐缓冲液 (pH-4.0)中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-lOO-A纳米颗粒沉淀;泳道7:在0.1 N HCL中脱附 的0ptiE2装载的SV-lO-x-140上清液;泳道8:在0.1N HCL中脱附的0ptiE2装载的SV-10-x-140纳米颗粒沉淀;泳道9:在0.1 % SLS中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-140上清液;泳道10: 在0.1 % SLS中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-140纳米颗粒沉淀;泳道11:在柠檬酸盐缓冲液 (pH-4.0)中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-140上清液;泳道12:在柠檬酸盐缓冲液(pH-4.0) 中脱附的0ptiE2装载的SV-lO-x-140纳米颗粒沉淀。
[0265] 在0.1%SLS的存在下观察到从囊泡脱附的非常低的量的蛋白。SV-lO-x-140和SV-10-X-100-A显示类似的吸附和脱附特性。SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A具有不同的孔径， 因此为了研究当与传统的佐剂Quil A共同施用时0ptiE2蛋白是否不同地结合至这些颗粒 (内部地或外部地），并且是否具有对免疫应答诱导的效应，使用SV-lO-x-140和SV-10-x-100-A囊泡进行了体内实验。
[0266] ELISA 数据
[0267] 小鼠用如表2中所述的疫苗制剂免疫。经免疫的小鼠的总I gG应答通过抗-Opt iE2 特异性ELISA测定在3次皮下疫苗注射后进行分析。0ptiE2装载的HSV疫苗制剂在注射前新 鲜制备。来自小鼠的PI血清样品在试验开始时收集，随后的血清样品在6周时期以两个星期 的间隔在每次注射后收集。所有小鼠在整个实验保持正常的体重范围。来自末端出血的 ELISA 结果（图 20)表明免疫原性组合物处理组(0ptiE2+SV-10-x-140,0ptiE2+SV-10-x-140 +Quil A，0ptiE2+SV-10-x-100-A，0ptiE2+SV-10-x-100-A+Quil A)和阳性对照组（0ptiE2 +Qui 1 A)显示高达1:6400稀释度的优良的抗体滴度，其平均0D450nm为1.20。在没有任何传 统佐剂的情况下用0ptiE2+HSV(SV)施用的处理组引起与对于阳性对照组所见的相当的抗 体应答。用BVDV 0ptiE2装载的未修饰的或官能化的HSV+Quil A注射小鼠组显示出几乎相 似的应答。HSV和传统佐剂的共施用不导致强健的免疫应答，因为Qui 1 A在疫苗制剂中的存 在没有显著增加应答。抗体应答的变化在接受0ptiE2+SV-10-x-100-A纳米制剂的四只小鼠 之间观察到。接受SV-10-x-140和SV-10-x-100-A HSV+Qui 1 A的阴性对照组显示出对 0ptiE2表位的低背景抗体应答。
[0268] ELISP0T 测定
[0269] 为了测定对0ptiE2抗原的T细胞介导的IFN-γ应答，使用ELISP0T测定。在最后一 次免疫后两周，收集和收获来自处死小鼠的脾脏以获得脾细胞群。接受纳米疫苗制剂 0ptiE2+SV-10-x-140、0ptiE2+SV-10-x-140+Quil A、0ptiE2+SV-10-x-100-A以及0ptiE2+ SV-10-x-100-A+Quil A的小鼠显示针对0ptiE2表位的优良的细胞介导的免疫应答。来自 ELISP0T测定的结果（图21，其中Ml至M4是每个组中的个体小鼠，黑条表示响应于0ptiE2抗 原产生IFN-γ的细胞的数目）表明接受抗原+中空二氧化硅囊泡的组看起来与用抗原装载 的HSV+传统佐剂施用的组差不多相似。然而，接受纳米疫苗制剂的组显示相较于阳性对照 组(OptiE2+Qui 1 A)更好的IFN- γ应答，突出显示了二氧化硅囊泡凭自身性质作为优秀佐 剂的效能。此外，用抗原装载的HSV处理的组相较于用抗原装载的HSV+传统佐剂处理的组引 起更好的Τ细胞介导的应答。SV+传统佐剂的共施用没有显著增加抗体应答以及IFN-γ应 答。阴性对照组、SV-10-x-140+Quil A、SV-10-x-100-A+Quil A和免疫组产生IFN-γ 应答。 但是，反应不是特异于0ptiE2抗原的，因为未免疫组也产生响应于0ptiE2表位的IFN-γ应 答。
[0270] 进一步的纳米疫苗实验
[0271] 前述实验清楚地表明，本发明的具有薄的壳壁、大的腔和入口尺寸的二氧化硅囊 泡改善了 0ptiE2蛋白吸附和释放。此外，0ptiE2(50yg)/SV-140(250yg)制剂相较于阳性对 照组0ptiE2(50yg)+Quil A(10yg)诱导更高的抗-0ptiE2IgG以及IFN-γ应答并用作自身佐 剂。在表明商业上有用的功效的同时，注意到为了获得良好水平的抗体和细胞介导的免疫 应答，动物接受三次纳米疫注射的施用。这一成功导致本发明人开发出可以使用BVDV E2作 为模型病毒抗原产生长期免疫应答的有效纳米疫苗。
[0272] 一般讨论;
[0273] 通常地，0ptiE2装载的二氧化硅囊泡(SV)_140的长期体内功能性在小鼠模型中通 过用0ptiE2+Quil A(100yg 0ptiE2+10yg Quil A)施用阳性对照组并用0ptiE2/SV-140 (100yg 0ptiE2吸附至500yg SV-140)施用纳米疫苗处理组进行测试。小鼠用两次注射接 种，并在六个月的时期在八个不同的时间点采集血样以分析抗体应答。在最后一次免疫后 在第3周（四只小鼠）和25周（四只小鼠）的两个不同的时间点收集来自处死小鼠的脾脏以测 定IFN- γ应答。纳米疫苗处理组0ptiE2/SV-140产生的BVDV特异性抗体应答在全部8个时间 点与常规佐剂Quil A是相当的。此外，在25周细胞介导的应答(这对于识别和消除侵入的病 原体是必需的）在用0ptiE2/SV-140免疫的所有四只小鼠中相较于用OptiE2+Quil A免疫的 小鼠（473-1500斑点形成单位(SFU)/百万个细胞)更高[1500斑点形成单位(SFU)/百万个细 胞]。这些实验证明SV诱导长期体液以及细胞介导的免疫应答的能力。免疫组化研究也显示 相较于BVDV E2Quil A，用BVDV E2SV制剂注射的小鼠中更高的应答。此外，组织病理学分析 在3周和25周对动物的所有主要器官进行以确保SV不具有有害效应。在研究中使用的所有 动物在整个实验期间保持健康。
[0274] 实验
[0275] 0ptiE2 在 SV-140 上的吸附
[0276] 吸附反应使用在2ml最终体积中含有0.2%Igepal CA630的无菌50mM Tris缓冲液 (ρΗ7·0)中的具有500yg 0ptiE2的2mg SV-140。该颗粒-蛋白浆液放置在室温(RT)的200rpm 摇床上。24小时后移出颗粒-蛋白浆液的样品（50μ1 )，并在16.2g下离心1分钟。未结合的 Opt iE2蛋白的量通过在SDS-PAGE凝胶上的上清液和颗粒的电泳评估。
[0277] 在小鼠中进行的免疫研究
[0278] C57BL/6J小鼠购自且在无特定病原体条件下饲养于Biological Resource Facility,The University of Queensland,Brisbane,Australia。八周大的雌性小鼠以每 组8只动物在环境控制的区域以12小时白天和12小时黑暗的循环饲养在HEPA过滤的笼中。 自由取用食物和水。动物在整个研究中密切监测。所有的动物在研究过程中保持良好的健 康且无可见的有害健康的影响。
[0279] 免疫前血液样品通过使用肝素涂覆的血细胞比容管（H i r s c h m a η η Lab〇rgerSte,Hei lbronn，Germany)的眼眶后出血收集。在首次免疫之前收集的免疫前 血液样品被称为免疫前(PI)样品。如上所述在无菌条件下制备吸附反应物，并且在制备最 终可注射剂量之前在lmL盐水中洗涤吸附的0ptiE2/SV沉淀。将QuilA(Superf〇S Biosector，Vedback，Denmark)以2mg/mL重悬浮在无菌注射用水（Pfizer，Brooklyn，USA) 中。施用可注射的剂量以研究通过0ptiE2+Quil A、0ptiE2/SV-140和未免疫组产生的免疫 应答之间的差异。小鼠的阳性对照组接受l〇〇yg OptiE2蛋白和10yg Qui 1A。处理组接受 0ptiE2(100yg)装载的SV-140(500yg)注射（下表ShlOOyL的剂量体积（在0.9%盐水中， Pfizer)通过使用无菌27号针头(Terumo, Tokyo，Japan)在尾基部皮下注射施用。两次注射 以3周间隔向所有的处理组施用，除未免疫组以外。在最终免疫后21天处死各组的四只小 鼠。来自剩余的四只小鼠的血液样品每4周收集多至25周，并且在试验期结束时处死动物。 每周一次对动物称重并监测其健康。此外，还观察它们的临床体征，并将疾病的任何体征如 下转换成数字评分:〇 =正常，1-4=中等变化，动物需要每日检测，5-10 =重大变化：由顾 问-动物设施的首席兽医官每日两次监测，>10 =安乐死。
[0280] 表3:进一步的小鼠试验中的免疫组。所有剂量在尾基部施用。
[0282] 酶联免疫吸附测定(ELISA)方案
[0283] 0ptiE2特异性抗体应答的检测：用于检测0ptiE2特异性抗体的ELISA通过用PBS中 的0ptiE2抗原溶液（2ng/μL，50μL)在4°C对微量滴定板（96孔，Nunc，Maxisorb，Roskilde， Denmark)涂覆过夜。除去涂覆溶液，将板用PBS-T( 1 X PBS，0.1 % Tween-20，Sigma-Aldrich) 洗涤一次，并用200yL PBS中的牛血清白蛋白（5%，Sigma-Aldrich)和脱脂乳（5%， Fonterra,Auckland,New Zealand)在RT轻轻摇动封闭1小时。板用PBS-T洗涤三次。
[0284] 小鼠血清样品在50yL PBS中从1:100稀释至1:6400,将各稀释液加入到经封闭的 板的孔中随后在室温下温育2小时。为了检测小鼠抗体，将在PBS中稀释至1:50000的HRP缀 合的多克隆绵羊抗小鼠 IgG抗体(Chemicon Australia,Melbourne，VIC,Australia)加入到 每个孔中，并在室温下轻轻摇动温育1小时。将板在PBS-T中洗涤三次。将TMB底物（100yL， Life Technologies)加入到每个孔中，并在室温下温育10分钟；将100yL IN HC1加入到孔 中以停止生色反应。在BioTek微板读数仪(Winooski，US)上以450nm读板。
[0285] 鼠脾细胞的分离和酶联免疫吸附斑点(ELISP0T)测定
[0286] 在安乐死后从在最终免疫后3周处死的4只动物和25周处死的另外四只动物无菌 取出脾脏，将收集的脾脏置于补充有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)、20mM Hepes (pH 7 · 3)、1M丙酮酸钠、1M Glutamax、100单位/mL青霉素 G、100yg/mL链霉素、0 · 25yg/mL两 性霉素 B的5mL冰冷的DMEM培养基中。将脾脏轻轻破碎，并使用注射器柱塞通过100μπι尼龙网 (Becton Dickinson)。细胞用5mL DMEM洗涤并离心（800g, 5min，4°C )，然后重悬浮于lmL裂 解缓冲液(0.15M NH4Cl，10mM KHC03,0.1mM Na2-EDTA)中，在室温下5分钟。重复两次每次用 DMEM(9mL和5mL)的洗涤步骤。细胞沉淀重悬浮于2mL DMEM中并且细胞数目通过用0.2%台 盼蓝染色来测定。来自每个小鼠脾脏的细胞以1.0-1.5xl05细胞/孔一式三份接种在用单克 隆干扰素 _γ (IFN-γ )(MabteCh，Sweden)捕获抗体预涂覆的聚偏二氟乙烯(PVDF)ELISPOT 板中。细胞在完全DMEM培养基中在37°C和5 %⑶2在lyg/mL OptiE2抗原或作为阳性对照的 多克隆活化剂伴刀豆球蛋白A(Con A, lyg/mL,Sigma Aldrich)的存在或不存在下温育40小 时。IFN-yELISPOT测定根据制造商的说明书进行。ELISP0T平板在ELISP0T读数仪 (Autoimmun Diagnostika,Strassburg,Germany)上读取。
[0287] 免疫组织化学
[0288] 脾脏切片在3周和25周的时间点从处死的小鼠收集。将脾脏的一部分解剖并在OCT 中冷冻，使用Hyrax C60低温恒温器切割5μπι切片。将具有冷冻切片的载玻片固定于冰上的 冷乙醇中进行8分钟，然后在室温干燥20分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3 X 5分钟，在RT干 燥20分钟，并使用Dako笔在切片周围标记圆圈。切片然后在4°C用封闭缓冲液（l%BSA+5% FBS+PBS)温育过夜。第二天，为了除去封闭液，将载玻片在PBS中洗涤3 X 5分钟。切片然后用 Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 IgG以1:500在室温在黑暗中温育1小时，然后在roS中洗涤载 玻片3X5分钟。为了染色细胞核，随后将切片用DAPI温育5分钟并在PBS中快速洗涤。将切片 用Pr〇Ij〇Il:g?Gold Antifade安装介质安装并在显微镜下检查。
[0289] 组织病理学
[0290]收集来自处死小鼠的心脏、肾脏、肝脏和注射部位并固定在10%福尔马林中48小 时。进一步处理器官并包埋在石錯中，用Leica RM 2245 Rotary Microtome切割8μηι切片。 然后使用下列苏木精和曙红染色程序将切片染色。切片首先在二甲苯中脱蜡(每次2分钟， 换液3次），然后在无水乙醇中再水化(每次2分钟，换液2次），在90 %乙醇中进行2分钟，在 70%乙醇中进行2分钟。然后在流动的自来水中洗涤2分钟，并在苏木精中染色3分钟，并再 次在流动的自来水中洗涤2分钟。然后将切片在70%的乙醇中洗涤2分钟，在曙红中染色3分 钟。然后将切片在95 %乙醇中洗涤2分钟，然后在无水乙醇中洗涤(每次2分钟，换液3次）。最 后，将切片迅速脱水并固定在二甲苯中（每次2分钟，换液3次)并安装在DePeX中。然后将切 片在显微镜下观察。
[0291] 莖里
[0292] 坚歷
[0293] 吸附测试通过用2mg SV-140温育500yg 0ptiE2蛋白24小时来进行。表达的0ptiE2 (下文被称为Opt iE2或oE2，该术语可互换使用）的分子量为42kDa。收集蛋白和颗粒浆液并 分离至上清液和颗粒样品，并通过SDS-PAGE分析以测定蛋白的吸附。凝胶分析表明在24小 时的结合后在上清液中没有检测到蛋白（图22-泳道3)，在颗粒沉淀中观察到0ptiE2与SV-140的完全结合(图22-泳道4)。
[0294] ELISA 数据
[0295] 小鼠用oE2+Quil A和OE2/SV-140疫苗制剂(如表3中所示）以两次皮下疫苗注射进 行免疫，在25周时期以3星期的间隔在每次注射后收集血清样品。在所有处理组中的动物保 持健康，并在整个实验保持正常的体重范围。免疫小鼠的总IgG应答通过抗-〇E2特异性 ELISA测定进行分析。在两个时间点3周和25周的来自末端出血的ELISA结果(显示于图23和 24中）显示用OE2/SV-140注射的纳米疫苗处理组和阳性对照组oE2+Quil A显示相似的减少 趋势，如对于抗体应答所预期的。未接受疫苗接种的阴性对照组没有显示特异于〇E2表位的 抗体应答。
[0296] 细胞介导的免疫应答的产生
[0297] ELISP0T测定法用于测定响应于oE2抗原的T辅助1型(Th 1)细胞介导的干扰素 -γ (IFN-γ )应答。最终免疫后3周和25周后，收集和收获来自各组的处死小鼠的脾脏以获得脾 细胞群。接受纳米疫苗制剂〇E2/SV-140的小鼠即使在最终免疫后25周也显示针对 〇Ε2抗原 的优异的细胞介导的免疫应答，如通过产生斑点形成单位(SFU)的细胞的数量所指示的。在 第3周，从四只处死小鼠（来自三个处理组)收集脾脏样品。6周数据表明，OE2/SV-140诱导的 细胞介导的应答(599-1500SFU/百万个细胞）与oE2+Quil A(551-1500SFU/百万细胞)是相 当的，因为每个处理组中的两只小鼠显示出低应答并且另外两只显示高应答(图25)。
[0298] 在25周处死的四只小鼠显示，相较于阳性对照组（473-1500SFU/百万个细胞）， OE2/SV-140诱导更强的细胞介导的应答（1500SFU/百万个细胞）（图26)<^ν-140囊泡在3周 以及25周后诱导抗体和细胞介导的应答的能力突出显示了其作为优良的自身佐剂和疫苗 递送载体的潜力。
[0299] 免疫组织化学数据
[0300] 免疫组织化学研究对小鼠脾脏切片进行。将切片用Alexa Fluor488山羊抗小鼠 IgG染色，并用DAPI染色核。脾脏切片中的绿色代表抗体应答的存在。〇E2/SV-140(图27c和 d)不仅在最终免疫后3周产生抗体应答，还在最终免疫后25周产生抗体应答。相较于阳性对 照〇E2+Quil A，〇E2/SV-140的IgG应答在两个时间点（3周和25周）上显示更强。在未免疫处 理组的切片中绿色的不存在确认阴性对照组中的小鼠没有产生抗体应答。
[0301] 组织病理学数据
[0302]收集来自处死小鼠的心脏、肾脏、肝脏和注射部位并固定在10%福尔马林中；对其 进一步处理并用苏木精和曙红染料染色。组织病理学结果表明，OE2/SV-140纳米疫苗的施 用在最终免疫后的时间点3周和25周对于心脏、肾脏、肝脏和注射部位不具有有害效应，因 为用OE2/SV-140注射的小鼠的切片看起来与阴性处理组（未免疫的）相似（图28i，ii，iii (比较c和d与e和f))。用〇E2+Quil A处理的动物的切片也看起来与未免疫组相似。这表明， 500yg的50nm SV-140的施用在动物中非常良好地耐受，并且其对于动物的主要器官不具有 任何有害效应。
[0303] 使用BVDV E2的纳米疫苗实验的结论
[0304] 吸附在合理设计的SV-140上的〇E2即使在最终免疫后的25周后也诱导抗-〇E2IgG 以及IFN-γ应答，表明SV用作有效的疫苗递送媒介物和强力佐剂的潜力。以三周间隔用两 个疫苗剂量施用动物，〇E2(100yg)+Quil A(10yg)和oE2(100yg)/SV-140(500yg)显示抗体 应答的相似减少趋势。OE2/SV-140相较于阳性对照 〇E2+Quil A产生强健的长期的细胞介导 的应答。免疫组织化学的结果证实，用OE2/SV-140处理的动物产生强烈的总IgG应答并且组 织病理学研究显示该注射较高剂量纳米疫苗（500yg)对于动物的主要器官不具有衰弱效 应。这些结果表明了 SV针对开发用于更安全和更有效的具有诱导长期体液以及细胞介导的 应答的能力的亚单位疫苗的新平台技术的开发是有用的。
[0305] 对无形体属的纳米疫苗实验
[0306] 接下来，从以200yg/mg颗粒的高吸附率将BVDV-E2吸附至二氧化硅囊泡(SV)(特别 是SV-140)相关的实验开始，决定将同样的方法用于来自边缘无形体(其是牛蜱热的致病生 物体)的2种不同的蛋白，VirB9.1(56KDa)和VirB9.2(44kDa)。蛋白在大肠杆菌系统中表达。 VirB9.1使用GST标签在Rosetta(DE3)pLysS细胞中表达，通过在15°C下用0.2mM IPTG诱导 17小时。将所得的可溶性蛋白通过色谱法分别使用GST亲和柱和Superdex 200 10/300 GL 尺寸排阻柱从细菌细胞裂解物纯化。纯化后，收集VirB9.1级分，浓缩并透析至PBS中用于进 一步的工作。VirB9.2使用pET-SUMO在BL21(DE3)细胞中表达，通过在37°C下用ImM IPTG诱 导5小时。所得的蛋白从不溶性包涵体级分纯化。增溶后，将VirB9.2透析至roS中用于进一 步的工作。
[0307] VirB9.1和VirB9.2的吸附在lxTOS缓冲液中分别在4°C和室温下进行。在SV100颗 粒上的吸附率对于VirB9.1 为200yg/mg，对于VirB9.2为 ^Oyg/mgJirBg.l 在SV100-NH2、 SV140 和 SV140-NH2 上的吸附率也约为 SOOyg/mgJirBgj在 SV100-NH2、SV140 和 SV140-NH2 上 显示相似的吸附（图29)。这个数据证实SV颗粒用作除BVDV E2以外的抗原性重要的蛋白的 载体的能力。VirB9.2从SV100和SV140的脱附被发现比氨基官能化的颗粒更好（图30)。基于 这些观察结果，将装载有VirB蛋白的SV100用于小鼠试验实验。VirB9.1和VirB9.2均被吸附 至SV100颗粒用于在小鼠试验中检查其诱导免疫应答的能力。将蛋白单独吸附至颗粒上并 制备含有各个体蛋白和组合的两种蛋白的纳米制剂的颗粒(表4)。
[0308] 表4:小鼠试验实验组。
[0311] VirB9.1和VirB9.2已被显示是连接蛋白并且连接蛋白的免疫可增加 T细胞依赖的 IgG应答(连接识别）以及呈递多于一个免疫原性蛋白（Morse等人.2012)。该实验的初步数 据显示吸附至SV100颗粒的VirB9.1和VirB9.2成功诱导体液免疫（图31和32)。
[0312] 来自针对VirB9.1的末端血清(最后一次注射后3周）的ELISA结果也显示出良好的 抗体应答（图33)。针对VirB9.2的末端血清的ELISA结果遵循关于VirB9.1的相似趋势。在三 次注射后获得的优良的细胞介导的免疫应答（图34和35)还显示与SV 100注射的VirB9.1和 ViRB9.2产生与作为传统佐剂的Quil-A相当的一致应答。
[0313] 在试验中，两组小鼠还用VirB9.1和VirB9.2的组合注射(表4)。组3(表4)采用了传 统的佐剂Quil-A，而组6包括含有在吸附后组合的单独吸附的VirB9.1/9.2的注射制剂(作 为混合纳米制剂）。用组合的VirB9.1和VirB9.2纳米制剂免疫的动物表现出良好的体液（图 31至33)和细胞介导的（图34和35)免疫应答，其与用个体VirB/SV制剂注射的小鼠的免疫应 答是相当的。更重要的是，用VirB9.1/SV单独接种的动物显示在ELISA(体液免疫应答，图31 至33)和ELI SPOT测定(细胞介导的应答，图34b和35b)中极小的与VirB9.2蛋白的反应性，反 之亦然。
[0314] 除了确认SV用作体内佐剂和载体蛋白的能力，来自组合免疫的免疫应答还显示， 各蛋白被免疫系统独立地加工，这表明SV可用于产生多价疫苗，其可以能够以单一剂量靶 向多种疾病。
[0315] 模型治疗蛋白通过二氧化硅囊泡的吸附容量和蛋白稳定性测试 [0316] 蛋白装载量和二氧化硅囊泡的入口尺寸的相关性
[0317]本发明人已发现本发明的二氧化硅囊泡（SV)的入口尺寸可以从〈3.9调整至34nm (图36中的菱形），而壁厚度保持在~6nm(图36中的圆形）。在用- C18链疏水性修饰后，SV的入 口尺寸在所有情况下减小l_2nm(图36中的方形）。治疗蛋白的装载量与SV的入口尺寸的关 系已使用这些系列的SV进行了研究。细胞色素 c(图36中的倒置三角形）和核糖核酸酶A(由 三角形表示的RNA酶A)已被用作模型治疗蛋白并且先前已讨论过结果。
[0318]如在图36中所示，这两个系列的SV的显示针对两种模型蛋白随入口尺寸增加的相 似的吸附容量趋势：当SV的入口尺寸等于壁度时，装载能力达到最大(对于疏水性修饰的SV 上的RNA酶A为563mg/g，对于未修饰的SV上的细胞色素 c为840mg/g)。
[0319] 为了进一步预测在官能化的SV样品上吸附的RNA酶A的位置，计算了 RNA酶A吸附容 量/每单位表面积(mg/m2)(表5)，用吸附容量除以BET表面积，排除了用于蛋白吸附的不可 用微孔面积。具有相同的疏水性修饰和~50nm粒度的固体Stdber球体也被用于RNA酶A吸 附以与sv进行比较，其显示18小时后的rna酶A的89mg/g装载量。对于修饰的Stdber球体， 清楚的是RNA酶A的吸附以单层吸附行为发生在外表面上。相较于5 0 nm的固体Stdb er球 体，SV-10-50-C18具有相同的尺寸但较弱的0.64mg/m2的吸附容量，其是Stdber球体 (1 · 13mg/m2)的一半。与固体StSber球体的情况下类似，RNA酶A只能被吸附到SV-10-50-C18的外表面上，因为它的入口尺寸比蛋白尺寸小。然而，排除微孔面积的BET表面积由通过 氮吸附测量的中空sv-io-5〇-c 18的内部和外部表面积组成，其是固体Stdber球体的表面 积的两倍，从而导致较低的吸附容量。s V -10 -10 0 - C i 8显示1.51 m g / m2的容量，这比固体 Stdber球体中的容量稍高。SV-10-100-C18的入口尺寸在疏水性修饰后<3.9nm。虽然确切 的入口尺寸不能从氮吸附技术测定，但考虑到SV-10-100具有6nm的入口尺寸并且修饰后的 入口尺寸减小在l_2nm的范围内，可以推断出，入口尺寸接近3 · 9nm。该入口尺寸接近蛋白尺 寸，从而RNA酶A可以装载到腔中，从而导致相对高的吸附容量。具有比RNA酶A的尺寸大得多 的入口尺寸的sv-io-wo-c^psv-io-ho-Cm显示两倍于Sidber球体的每单位面积吸附 容量，表明RNA酶A不仅吸附在二氧化硅壳的表面上，还通过多层吸附进入腔内。
[0320] 表5:二氧化硅纳米颗粒的计算的核糖核酸酶A吸附容量
[0322] SBET : BET表面积；SMicr。: t-曲线微孔面积；SBET-Micro : BET表面积-t-曲线微孔面积； CrNARA : RNA酶A吸附容量;(/ RNase A: RNA酶A吸附容量/m2 ( CRNA酿/SBET-Micro )
[0323] 疏水性修饰的SV中装载的RNA酶A的热稳定性
[0324] RNA酶A的热解折叠通过在10-130°C的范围内的差示扫描量热法(DSC)测定。DSC使 用VP DSC微量热计(MicroCal Company，USA)以60°C/h的加热速率进行。在典型的程序中， 将RNA酶A/SV以0.5mg/ml的RNA酶A浓度悬浮于1 OmM PBS溶液中。还仅使用SV以相同浓度制 备参考悬浮液。将参考和样品悬浮液注射在相应的细胞中用于DSC测量。还获得游离RNA酶A 的DSC曲线。图37显示了以RNA酶A/SV悬浮液的温度为X轴且表观摩尔热容(Cp)为y轴(其是 基线基底并且通过RNA酶A的浓度标准化）的一系列DSC曲线。游离RNA酶A的DSC曲线显示了 指示RNA酶A的热解折叠的吸热峰。RNA酶A热解折叠的中点温度(T m)还被测量为以63.6°C为 中心，与文献报道一致。装载在SV-10-120-C18中的RNA酶A增加至~119°C，比RNA酶A/SV-10-50-Cis(71 · 9°C)和RNA酶A/SV-10-140-Ci8(74 · 9，118°C )的Im高得多。DSC结果显示，相较于在 外表面上吸附RNA酶A的SV-10-50-C18和具有大入口尺寸的RNA酶A/SV-10-140-C 18,装载在 具有~6nm的入口尺寸的疏水性修饰的SV中的RNA酶A显示在PBS中最高的热稳定性。
[0325] 装载在疏水性修饰的SV中的RNA酶A在酸和热处理后的活性
[0326] 装载在疏水性修饰的SV中的RNA酶A的稳定性和活性用酸和热处理进行进一步研 究。在处理程序中，将50μ1 0.01M HCl(pH 2)添加至装载在SV中的~lmg RNA酶A。混合物保 持在65 °C40分钟，然后用0.01M NaOH溶液(pH 12)中和直到pH达到7。最终的RNA酶A浓度随 后稀释至〇.5mg/ml。游离的RNA酶A也相应处理作为对照组。为了研究处理后RNA酶A的二级 结构变化，RNA酶A/SV悬浮液的圆二色(CD)光谱以SV悬浮液作为参考进行测量。图38显示在 波长范围 200-230nm 中的 CD 光谱的强度是 RNA 酶 A/SV-10-120-Ci8>RNA 酶 A/SV-10-140-Ci8> RNA酶A/SV-10-50-C18>RNA酶A/SV-10-120。更高的强度指示更多的二级结构在处理后得到 维持。因此，装载在SV-10-120-C 18中的RNA酶A显示在酸和热处理后的最高含量的二级结构。
[0327] 酸和热处理后的RNA酶A/SV-10-120-C18随后用于细胞递送以进一步测试RNA酶A的 活性。采用先前描述的程序。如图39中所示的，SV-10-120-C 18即使在72小时后仍显示对 SCC25和HCT116细胞的最小化的细胞毒性，表明了官能化的SV样品的优异的生物相容性。当 SCC25和HCT116细胞用游离的RNA酶A处理时，没有看到抑制，因为裸露的蛋白不能进入细 胞。通过SV-10-120-C 18递送的RNA酶A显示时间依赖性细胞毒性，其中细胞抑制能力随着暴 露时间从16μg/ml的RNA酶A浓度逐渐增加而增加（图39A)。同样的趋势可在HCT 116细胞中观 察到，其中细胞抑制为24小时的33%至48小时的48%，最后在72小时为69% ANA酶A/SV-10-120-C18的细胞抑制能力证实了在酸和热处理后RNA酶A的稳定性和保留的活性。
[0328]大多数治疗蛋白具有脆弱的结构，很容易经历变性或被蛋白酶消化。例如，蛋白需 要在口服递送期间避免胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，并在静脉内注射中避免纤溶酶。在本实 验中，RNA酶六/3￥-10-120-(： 18用胰蛋白酶消化，并且剩余的完整RNA酶的量通过质谱(MS)来 定量检测。首先装载在SV中的lmg RNA酶A用二硫苏糖醇在60°C处理30分钟。该过程是为了 打破游离RNA酶A中的二硫键。其次，将RNA酶A/SV在37 °C添加至roS溶液中的lmg/ml胰蛋白 酶（1: 50 )，振荡约12h。然后将混合物离心，并将上清液从沉淀物中移除。将沉淀物点到 MALDI MPT 384板上，并在测试前与ΙμL CHCA溶液混合。样品在Bruker Autoflex T0F/T0F III Smart光束上分析。在LP-PepMix模式中通过累积10个不同部位上在39%激光强度下的 200个激光射击来获得质谱用于数据收集并进行校准。三个标准肽，血管紧张素 II(Mw = 1046.5Da)、ACTH-Clip(Mw = 2465.2Da)和促生长素抑制素28(Mw 3147.5Da)被用于校准目 的，以减少可变性。图40A显示了RNA酶A/SV-10-120的MS，其显示了以质荷比从1000-5000变 化的一系列峰。这些峰可全归因于胰蛋白酶对完整的RNA酶A的消化产生的肽。相比较而言， RNA酶A/SV-lO-WO-Ci^MS显示在13.7k的质荷比上的小峰，其是完整的RNA酶A的质量。因 此，当通过疏水性修饰的SV吸附时，RNA酶A的量在胰蛋白酶消化处理后得到保留，而在无修 饰的情况下装载的RNA酶A被完全消化。
[0329]本文中所呈现的结果显示，具有接近蛋白尺寸的入口尺寸的SV显示出模型治疗蛋 白的最高装载量。通过用RNA酶A作为例子，可以预测，在SV-lO-UO-Ci^装载的RNA酶A的位 置不仅在外表面上还在SV腔中。此外，这些实验表明，具有~6nm的入口尺寸和疏水性修饰 的3￥-10-120-& 8显示保护RNA酶A免受热或潜在的酸或胰蛋白酶消化的不利条件。在SV-10-120-&8中装载的RNA酶A还在即使用热和强酸处理后显示对癌细胞的成功抑制。该发现是令 人惊讶的，并提供了先前未在本领域中发现的重要认识，其对于设计用于治疗蛋白递送的 有效的保护性纳米载体将是至关重要的。
[0330]在以下权利要求中和在本发明的前述描述中，除非上下文清楚地要求，否则由于 表达语言或必要的含义，词语"包括"，或其变体，包括"包含"或"含有"，以包含性意义使用， 即，指定所陈述的元素的存在，但不排除本发明的一个或多个实施方案中的其它元素的存 在或添加。
【主权项】
1. 一种产生二氧化硅囊泡的方法，其包括以下步骤： (a) 通过将可水解的二氧化硅源添加至包含嵌段共聚物的水溶液来产生二氧化硅制 剂，将所述二氧化硅制剂保持在低于20°C的温度，并搅动所述制剂直至形成二氧化硅-聚合 物复合囊泡，随后进行步骤(b)或步骤(c); (b) 升高含有二氧化硅-聚合物复合囊泡的二氧化硅制剂的温度至25°C至100°C，并搅 动混合物以形成在囊泡壁内具有球形结构的二氧化硅-聚合物复合囊泡； (c) 使所述囊泡暴露于水热处理;和 (d) 煅烧所述囊泡，以由此产生二氧化硅囊泡。2. 权利要求1的方法，其中所述可水解的二氧化硅源是烷基正硅酸盐。3. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述嵌段共聚物是烯烃三嵌段共聚物。4. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述嵌段共聚物是聚（氧化乙烯）_聚（氧化烯 烃)_聚(氧化乙烯)嵌段共聚物。5. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(a)中，将所述二氧化硅制剂保持在5°C 至15 °C的温度。6. 前述权利要求中的任一项的方法，其中在步骤(b)中，将温度升高至30°C至85°C。7. 前述权利要求中的任一项的方法，其中在步骤(a)之后进行步骤(b)，随后进行步骤 (c)，随后进行步骤(d)。8. 前述权利要求中的任一项的方法，其中所述水热处理在90°C至200°C的温度下进行。9. 前述权利要求中的任一项的方法，其中所述水热处理在大于0.7巴和小于10巴的升 尚的压力下进行。10. 前述权利要求中的任一项的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)中的搅动是搅拌。11. 前述权利要求中的任一项的方法，其中在煅烧后疏水性地修饰所述二氧化硅囊泡 的表面。12. -种二氧化硅囊泡，其具有： (&)30至7〇]11]1的粒径； (b) 通过球形孔穿孔的壁结构;和 (c) 在壁中形成的4至40nm的平均孔入口尺寸。13. 权利要求12的二氧化硅囊泡，其中所述二氧化硅囊泡的表面是经修饰的。14. 权利要求13的二氧化硅囊泡，其中所述二氧化硅囊泡的表面比原始二氧化硅囊泡 表面更疏水。15. -种二氧化硅囊泡，其由权利要求1至11中任一项的方法产生。16. -种药物或化学品递送系统，其包含权利要求12至权利要求15中任一项的二氧化 硅囊泡和包封在囊泡内和/或结合至其外表面的药物和/或化学剂。17. -种免疫原性组合物，其包含一个或多个根据权利要求12至权利要求15中任一项 的二氧化硅囊泡和一个或多个免疫原。18. 权利要求17的组合物，其中所述免疫原被包封在二氧化硅囊泡的外部范围内或结 合至其外表面。19. 权利要求17或权利要求18的组合物，其中所述免疫原是牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 的免疫原性片段。20. 权利要求17至权利要求19中任一项的组合物，其中所述免疫原性组合物包含多个 具有基本上相同的特征的二氧化硅囊泡，所述二氧化硅囊泡呈递或包封多个具有彼此不同 的结构和/或功能特征的免疫原。21. 权利要求17至权利要求19中任一项的组合物，其中所述免疫原性组合物包含多个 具有彼此不同的结构特征的二氧化硅囊泡，所述二氧化硅囊泡呈递或包封具有基本上相同 的结构和/或功能特征的免疫原。22. -种在受试者中引发免疫应答的方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效 量的权利要求17至权利要求19中任一项的免疫原性组合物的步骤。23. 权利要求22的方法，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答或抗体免疫应答。24. -种预防或治疗疾病或病况的方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效量 的权利要求17至权利要求21中任一项的免疫原性组合物的步骤。25. 权利要求12至权利要求15中任一项的二氧化硅囊泡以及免疫原在制备用于治疗疾 病或病况的药物中的用途。26. 权利要求25的用途，其中所述免疫原是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的免疫原性片段。27. 权利要求12至权利要求15中任一项的二氧化硅囊泡用作佐剂的用途。
【文档编号】A61K9/50GK105980447SQ201480075307
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】C·于, N·密特尔, J·张
【申请人】昆士兰大学