基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法
【专利摘要】本发明属分子生物学技术领域，具体涉及基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法。本发明针对474个激酶的shRNA文库高通量RNAi筛选技术在HEK293T中稳定表达HIV-1 LTR-hRluc/HSVTK-hLuc荧光素酶双重报告质粒，hRluc表达荧光强度的HIV-1 LTR相对转录活性除以hLuc的荧光强度，获得由激酶参与的HIV-1 LTR调节转录活性；本发明的方法，其针对人激酶基因，进行功能性沉默筛查，寻找与HIV复制相关宿主因子，为进一步理解HIV与宿主之间的相互作用，以及寻找抗HIV感染的潜在治疗靶点提供了有价值的参考依据。
【专利说明】
基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法
技术领域
[0001] 本发明属分子生物学技术领域。涉及筛选HIV-1活性的决定因子的方法，更具体 地，涉及基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了目前已知的人免疫缺陷病毒（HIV-1)基因组仅编码15个蛋白，其 从入侵、复制、组装到出芽释放的生命周期需要利用宿主编码蛋白完成，因此，HIV感染所需 宿主因子将成为治疗HIV的潜在靶点。据诸多研究报道，激酶在上述HIV生命周期各个阶 段起着重要的调控作用。
[0003] 由激酶参与的HIV-1 LTR调节转录活性成为本领域研究的关注点之一，迄今为止， 尚未见有关针对人激酶基因进行功能性沉默筛查、寻找与HIV复制相关宿主因子的相关报 道，鉴于此，本申请的发明人拟提供一种筛选HIV-1活性的决定因子的方法，尤其是基于高 通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法；该方法将为进一步理解HIV与宿主之间的相 互作用，以及寻找抗HIV感染的潜在治疗靶点提供有价值的参考依据。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷或不足，提供一种筛选HIV-1活性的决定因 子的方法，具体涉及在宿主激酶中基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法。该 方法将为进一步理解HIV与宿主之间的相互作用，以及寻找抗HIV感染的潜在治疗靶点提 供有价值的参考依据。
[0005] 本发明针对474个激酶的shRNA文库高通量RNAi筛选技术在HEK293T中稳定表达 HIV-1 LTR-hRluc/HSV TK-hLuc荧光素酶双重报告质粒，hRluc表达荧光强度的HIV-1 LTR 相对转录活性除以hLuc的荧光强度，获得由激酶参与的HIV-1 LTR调节转录活性；
[0006] 本发明中，采用两个阳性对照NF k B and AKT1，用于筛选作为shRNA或特定的抑 制剂；NFkB或AKT1激酶活性抑制剂抑制HIV-1 LTR的活性超过30%，表明筛选系统可靠； 最初的筛选结果显示155个阳性样本数针对136个基因抑制的HIV-1 LTR活性超过20%， 然后上述155个样本进入第二个筛选系统，获得了 15个阳性基因，结果如表1所示；
[0007] 表 l.qPCR?引物
[0008]
[0009] 更具体的，本发明的基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法，其特征 在于，其包括步骤：
[0010] (1)制备人激酶（Kinase) shRNA慢病毒文库
[0011] 针对每个基因，设计8条shRNA，编号A-H，以保证每个基因至少有1-2条shRNA有 效抑制其表达；在高通量筛选的病毒包装时，将A-D质粒混合，E-H质粒混合，分别进行包 装，因此，每个基因针对2个病毒，分别包含4条shRNA序列；
[0012] (2)筛选：慢病毒文库感染293T HIV 5' LTR-luciferase稳定株，感染后96h进行 luciferase 检测
[0013] 采用的报告基因载体同时表达Reni 11a luciferase (hRluc)和firefly luciferase (hluc+)，hRluc 反应 HIV 5' LTR 启动子活性，hluc+ 做为内参，hRluc/hluc+ 表 示单位细胞内HIV 5' LTR启动子活性；
[0014] ⑶数据分析，确定阳性基因
[0015] 数据统计时，对照慢病毒组的结果标准化为1，RNAi慢病毒组的结果标准化为相 对值Y ;
[0016] 设定Y〈0. 8为阳性变化，表示RNAi该基因后，可抑制HIV 5'LTR的启动子活性；针 对有阳性变化的基因进行重复验证，再从可重复的基因中挑选感兴趣的阳性基因；
[0017] (4)有效shRNA靶点确认：独立包装阳性基因的4个shRNA慢病毒，Luciferase和 qPCR实验确定有效shRNA靶点
[0018] 筛查有效shRNA靶点时，每个基因的8个shRNA慢病毒独立感染细胞，luciferase 检测启动子活性，针对有阳性变化shRNA序列，qPCR检测阳性基因的沉默效率；
[0019] (5)选取阳性基因进行功能研究。
[0020] 本发明进行了实验验证：
[0021] 1.检测阳性对照HIV-LTR活性中的特异性激酶
[0022] 评估上述15个阳性基因的特异性，使用由每一个shRNA库组成的种属进行验证， 结果显示，6个针对5个激酶的shRNA种属抑制HIV-1 LTR活性超过了 20%;敲除的效果通 过qPCR检测，结果显示在阳性对照HIV-LTR活性中有4个特异性激酶：AK1，EphB2, PRKACB 和⑶K5R2沉默特异性抑制HIV-1 LTR活性；
[0023] 2. AK1和PRKACB的过表达上调HIV-1 LTR的活性
[0024] 进一步显示激酶对于HIV-1 LTR活性的作用，AK1和PRKACB与C末端Flag-tag 过表达；Western blotting实验显示AK1和PRKACB在HEK293T细胞中共表达可稳定表达 HIV-1 LTR-hRluc/HSV TK-hLuc双重报告质粒；AK1过表达上调HIV-1 LTR48%的活性，而 PRKACB过表达提高HIV-1 LTR活性90% T ;结果表明，AK1和PRKACB在HIV-LTR活性阳性 对照中，AK1和PRKACB的过表达上调HIV-1 LTR的活性；
[0025] 3. AK1 或 PRKACB 的敲除抑制 HIV-1 LTR 活性
[0026] 进一步探讨AK1和PRKAC正向调节HIV-1 LTR活性的潜在机制，AK1或PRKACB沉 默HEK293T细胞被应用于DNA微矩阵分析中；分别有132个和93个显著表达改变的基因 (表达差别高于50%，p〈0. 05)，然后AK1和PRKACB敲除，在AK1和PRKACB沉默的HEK293T 细胞中有69个基因发生重叠，并进行IPA分析；IPA结果显示，TGF-P信号通路和p53信 号通路在AK1和PRKCAB敲除后发生显著改变；IPA网络分析显示病毒感染，凋亡和肾脏细 胞系细胞死亡显著抑制以后的AK1和PRKACB敲除；此外，IPA上游因子分析显示ERK1/2和 P38MAPK信号通路下调与NF- k B信号通路的抑制有关；AK1或PRKACB的敲除通过NF- k B 信号通路抑制HIV-1 LTR活性。
[0027] 本发明提供了一种基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法，其针对人 激酶基因，进行功能性沉默筛查，寻找与HIV复制相关宿主因子，为进一步理解HIV与宿主 之间的相互作用，以及寻找抗HIV感染的潜在治疗靶点提供了有价值的参考依据。
【附图说明】
[0028] 图1.在HEK293T稳定表达的HIV-1 LTR-hRluc/HSV TK-hLuc双荧光素酶报告质 粒中针对474个激酶的shRNA文库的高通量RNAi筛选。
[0029] 图2 :第二次筛选中的确认为阳性基因数。
[0030] 图3. AK1或PRKACB上调HIV-1 LTR活性的过度表达。
[0031] 图4. IPA结果显示在AK1-沉默和PRKACB沉默细胞之间有69个重叠基因。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1检测由激酶参与的HIV-1 LTR调节转录活性
[0033] 采用针对474个激酶的shRNA文库高通量RNAi筛选技术在HEK293T中稳定表达 HIV-1 LTR-hRluc/HSV TK-hLuc荧光素酶双重报告质粒；hRluc表达荧光强度的HIV-1 LTR 相对转录活性除以hLuc的荧光强度（如图1A所示）；
[0034] 采用两个阳性对照，NF k B and AKT1，用于筛选作为shRNA或特定的抑制剂（如 图1B所示）；NF k B或AKT1激酶活性抑制剂抑制HIV-1 LTR的活性超过30%，表明筛选系 统可靠；此外，最初的筛选结果显示155个阳性样本数针对136个基因抑制的HIV-1 LTR活 性超过20% (如图1C所示），然后上述155个样本进入第二个筛选系统，获得了 15个阳性 基因，结果如表1所示；
[0035] 表 l.qPCR?引物
[0036]
o
[0037] 本实验结果显示：
[0038] 1)在阳性对照HIV-LTR活性中有4个特异性激酶
[0039] 评估获得的15个阳性基因的特异性，使用由每一个shRNA库组成的种属进行验证 (如图2A所示）；6个针对5个激酶的shRNA种属抑制HIV-1 LTR活性超过了 20% (如图 2B所示）；敲除的效果通过qPCR检测；结果显示，AK1，EphB2, PRKACB和CDK5R2沉默特异性 抑制HIV-1 LTR活性；
[0040] 2)AK1和PRKACB的过表达上调HIV-1 LTR的活性
[0041 ] AK1 和 PRKACB 与 C 末端 Flag-tag 过表达；Western blotting 实验显不 AK1 和 PRKACB在HEK293T细胞中共表达可稳定表达HIV-lLTR-hRluc/HSV TK-hLuc双重报告质粒 (如图3A所示）；AK1过表达上调了 HIV-1 LTR48 %的活性，而PRKACB过表达提高HIV-1 LTR活性90% T (如图3B所示）；结果表明，AK1和PRKACB在HIV-LTR活性阳性对照中；
[0042] 3)DNA微矩阵分析结果提示AK1或PRKACB的敲除通过NF- k B信号通路抑制HIV-1 LTR活性
[0043] 采用DNA微矩阵分析了 AK1或PRKACB沉默HEK293T细胞，分别有132个和93 个显著表达改变的基因（表达差别高于50%，p〈0. 05)，然后AK1和PRKACB敲除，在AK1 和PRKACB沉默的HEK293T细胞中有69个基因发生重叠，并进行IPA分析；IPA结果显示 TGF-P信号通路和p53信号通路在AK1和PRKCAB敲除后发生显著改变（如图4A所示）； IPA网络分析显示病毒感染，凋亡和肾脏细胞系细胞死亡显著抑制以后的AK1和PRKACB敲 除（如图4B所示）；此外，IPA上游因子分析显示ERK1/2和p38MAPK信号通路下调与NF-k B 信号通路的抑制有关（如图4C所示），AK1或PRKACB的敲除通过NF- k B信号通路抑制 HIV-1 LTR活性，实验结果揭示了 AK1和PRKAC正向调节HIV-1 LTR活性的潜在机制。
【主权项】
1. 基于高通量RNAi筛选HIV-ι活性的决定因子的方法，其特征在于，其包括步骤： (1) 制备人激酶（Kinase) shRNA慢病毒文库； (2) 筛选：慢病毒文库感染293T HIV 5'LTR-luciferase稳定株，感染后96h进行 luciferase 检测； (3) 数据分析，确定阳性基因； (4) 有效shRNA靶点确认： 独立包装阳性基因的4个shRNA慢病毒，Luciferase和qPCR实验确定有效shRNA靶 占 . (5) 选取阳性基因进行功能研究。2. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中，针对每个基因，设计8条 shRNA，编号Α-Η，以保证每个基因至少有1-2条shRNA有效抑制其表达；在高通量筛选的病 毒包装时，将A-D质粒混合，E-Η质粒混合，分别进行包装，因此，每个基因针对2个病毒，分 别包含4条shRNA序列。3. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中，采用的报告基因载体同时 表达 Renilla luciferase(hRluc)和 firefly luciferase(hluc+)，hRluc 反应 HIV 5，LTR 启动子活性，hluc+做为内参，hRluc/hluc+表示单位细胞内HIV 5' LTR启动子活性。4. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中，数据统计时，对照慢病毒组 的结果标准化为1，RNAi慢病毒组的结果标准化为相对值Y ; 设定Y〈〇. 8为阳性变化，表示RNAi该基因后，抑制HIV 5' LTR的启动子活性；针对有阳 性变化的基因进行重复验证，从可重复的基因中挑选感兴趣的阳性基因。5. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑷中，筛查有效shRNA靶点时，每 个基因的8个shRNA慢病毒独立感染细胞，luciferase检测启动子活性，针对有阳性变化 shRNA序列，qPCR检测阳性基因的沉默效率。
【文档编号】C12Q1/02GK106032550SQ201510107692
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月12日
【发明人】卢洪州, 蒋卫民
【申请人】上海市公共卫生临床中心