马铃薯疮痂病菌定量分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了马铃薯疮痂病菌的定量分子检测方法，根据NCBI GenBank中已登记的马铃薯疮痂病菌特有的毒素合成基因簇中的txtA、txtB保守基因序列设计荧光定量PCR引物，筛选到符合qPCR条件的引物RTA1/RTA2，经检测，其在各测试菌株中的扩增结果稳定，片段大小符合要求，并且无引物二聚体形成，可以作为qPCR检测引物。分别对4种疮痂病菌测试菌株的孢悬液进行定量并提取DNA，稀释至不同浓度作为模板，利用qPCR技术建立标准曲线。利用建立的标准曲线对土壤样品及病组织样品进行测试，结果表明其可对样品进行定量测定(附图)。
【专利说明】
马铃薯疮痂病菌定量分子检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子检测方法的发明，特别指马铃薯疮痂病致病菌的定量分子检测方 法的建立。
【背景技术】
[0002] 马铃薯疮痂病对生产的影响日益严重，已经引起国内外研究者的高度关注，该 病的病原菌组成具有明显的多样性，国内已发现存在X scabies、51 acit/iscaAies、51 等四种病原(赵伟全等，2006)，对各病原菌进行系统分析 后发现，不同种的菌株间生物学特点有较大差别(张萌等，2010)。因此对其建立特异性的定 量检测方法十分必要。
[0003] 对马铃薯疮痂病菌基因组的深入研究发现合成毒素的致病基因聚集在一个大 的染色体区域，作为一个致病岛存在于链霉菌中，包含tiA ixi从等多个基 因。疮痂病菌的致病性是和致病岛密切相关的[77]。致病岛包含了比较大的染色体区域 (10~200kb)，仅仅出现在致病株的染色体中，而在非致病株不存在 [75'76]。引起疮痂病的 thaxtomin A的生物合成是在疮痂病致病种的单基因座（上，和度扁码合成的 4_硝基吲哚和L-苯丙氨酸具有甲基化和环化二肽合成酶的功能。
[0004] SYBR Green I染料是一种非饱和菁类荧光素，能非特异性嵌合于DNA双螺旋结构 的小沟内，当DNA处于游离状态时，荧光信号弱，但是当与dsDNA结合后荧光强度明显增强， 可被荧光探测系统检测到，荧光信号的强弱与初始模板的dsDNA是成比例的，因此可进行 核酸的定量分析。在病原菌检测方面，荧光定量对模板能快速、准确的定量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对定量检测马铃薯疮痂病菌的引物RTA1/RTA2。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供一种马铃薯疮痂病菌的定量检测方法。
[0007] 本发明的整体技术构思是：在此研究中对我国存在的四种模式菌株进行了孢子基 因组DNA的提取。根据上述致病岛中的不同基因序列设计了 4对引物，筛选到qPCR引物后 通过对建立各菌株标准曲线条件的摸索，建立了马铃薯疮痂病菌不同菌株孢子的定量检测 方法。应用标准曲线对提取的病组织及带菌土壤进行检测，证明了所建立标准曲线的重复 性强，可用性高。同时可以根据DNA的浓度计算孢子数。
[0008] 以我国发现的具有代表性的致病菌株CPS-1 (5： 、CPS-2 (5： 为模式菌株，首先建 立模式菌株中DNA浓度和孢子量的关系，然后根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列 fcriA fcr仿设计引物。以各菌株孢子基因组DNA为模板筛选疮痂致病链霉菌qPCR的通用 引物。对模式菌株定量孢子提取的DNA进行多次的浓度梯度条件摸索，最终筛选到合适的 浓度梯度，为标准曲线建立点的筛选奠定基础；建立标准曲线，提取马铃薯疮痂病组织以及 带有疮痂病菌的土壤DNA对建立的标准曲线进行稳定性验证。
[0009] 本发明的研究方法包括： A、 平板计数法定量各菌株孢悬液浓度，提取定量孢子的基因组DNA，建立孢子数量和 DNA浓度的关系； B、 qPCR引物的设计及引物的筛选； C、 标准曲线建立点的筛选； D、 标准曲线的建立及应用。
[0010] 设计的全部引物序列见下表： 表1本研究设计的引物序列
各菌株不同浓度DNA下的Ct值和换算的孢子数见下表：
步骤A是用平板计数法将燕麦固体培养基（OMA)上培养的菌株CPS-1 (5： 、 galilaeiL^)、acidiscabie;^)、turgidiscabie;^)鬼赛 Vd 夭 的孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行lOSloL^O113倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50 mL涂 布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数。用CTAB法提 取一定量菌株孢子的基因组DNA，所提基因组DNA的浓度及各项参数由紫外分光光度仪测 得，知道浓度后建立孢子数和浓度之间的关系。
[0011] 步骤B是以步骤A中的DNA为模板进行PCR扩增，根据疮痂病菌特有的毒素合成 基因簇序列（xiA fcr仿设计四对特异性引物RT1/RT2、RTA1/RTA2、RTB1/RTB2、RTB3/RTB4。 用设计的引物对模式菌株的基因组DNA进行扩增。先将引物稀释成10 ymol/L。扩增反应 体系为 50 mL，模板（基因组 DNA) :1 mL;引物：各 1 mL;2XGC buffer II :25 mL;dNTP(2 mM) :1 mL 酶：0? 7 mL ;ddH20 :20. 3 mL。扩增条件为 95°C预变性 5 min，95°C变性 30 s， 62°C退火50 s，72°C延伸1 min，30个循环，最后72°C延伸5 min。扩增结束后，取4mL的 扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶90 V /40 min电泳检测。PCR产物在2.0 %的琼脂糖凝胶 电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pGM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5 a上， 在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因 库（GenBank)上进行序列分析，验证所得片段并选取效果最好的扩增片段作为检测探针， RTA1/RTA2扩增的目的片段测序结果稳定正确，扩增的条带大小符合qPCR所要求的条件， 并且没有引物二聚体情况。
[0012] 步骤C是根据步骤B确定好的反应条件将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度 后进行 101, 1〇2,4 X 102,8 X 102, 103,4 X 103，6 X 103,8 X 103,104, 2 X 104,4 X 104,8 X 104,105 倍不同梯度稀释。确定反应体系的最低检测浓度。并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计 算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。
[0013] 步骤D是根据步骤B和C应用qPCR的反应条件进行标准曲线的建立，SYBR Green I qPCR 反应体系（10 mL)为：PCR Mix :51mL ;引物：各 0? 2 mL ;模板(孢子 DNA):0. 2 mL;ddH20:4.4 mL。SYBR Green I qPCR 反应程序：预变性：94°C，5 min;40 个循环：变性： 94°C，5 s，复性：62°C，30 s。对样品进行了 12个点的稀释，但由于后面模板的稀释度越来 越大，扩增曲线的线性关系不是很明显，因此，选择了其中线性关系比较好的五个点做标准 曲线。采集接种有CPS-1、CPS-4菌株的土壤中提取的DNA进行检测：每土壤样品称取5 g 加至装有5 ml无菌水的离心管中进行漩涡振荡10 min，静置待土壤颗粒沉淀后，取上清液 离心富集菌体后，用CTAB法提取土壤样品的总基因组DNA，以其为模板进行qPCR以验证标 准曲线的实用性。
[0014] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明利用qPCR方法筛选到了扩增 结果稳定，片段大小符合要求，并且无引物二聚体形成，可以作为qPCR检测引物的RTA1/ RTA2。应用此引物建立了中国马铃薯疮痂病菌比较常见的几种病原菌标准曲线，建立了马 铃薯疮痂病菌的定量检测方法。该工作提高了病原菌检测的灵敏度，为以后预防马铃薯疮 痂病的工作奠定了基础，对马铃薯疮痂病的预防有较高的实际应用价值。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0016] 图 1 是对四种模式菌株 CPS-1 (5： scabies), CPS-2 (^. galilaeus), CPS-3 (^. (51 的 PCR 扩增结果； 图2是菌株CPS-4标准曲线对样品的检测。
【具体实施方式】
[0017] 以我国发现的具有代表性的致病菌株CPS-1 (5： waAid、CPS-2 (5： acit/iscaAies)、CPS-4 (51 为模式菌株，首先建 立模式菌株中DNA浓度和孢子量的关系，然后根据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列 fcriA fcr仿设计引物。以各菌株孢子基因组DNA为模板筛选疮痂致病链霉菌qPCR的通用 引物。对模式菌株定量孢子提取的DNA进行多次的浓度梯度条件摸索，最终筛选到合适的 浓度梯度，为标准曲线建立点的筛选奠定基础；建立标准曲线，提取马铃薯疮痂病组织以及 带有疮痂病菌的土壤DNA对建立的标准曲线进行稳定性验证。
[0018] 依据上述的整体研究思路具体的研究方法包括： 1、平板计数法定量各菌株孢悬液浓度，提取定量孢子的基因组DNA，建立孢子数量 和DNA浓度的关系。用平板计数法将燕麦固体培养基（OMA)上培养的菌株CPS-1( 5： scabies) > CPS-2 (S. galilaeus) > CPS-3 (S. acidiscabies) > CPS-4 (^. turgidiscabies) 培养10天的孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行101，102-1〇1(]倍梯度稀释，取稀释好的孢悬 液50 mL涂布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数。用 CTAB法提取一定量菌株孢子的基因组DNA，所提基因组DNA的浓度及各项参数由紫外分光 光度仪测得，知道浓度后建立孢子数和浓度之间的关系。
[0019] 2、qPCR引物的设计及引物的筛选。是以步骤1中的DNA为模板进行PCR扩增，根 据疮痂病菌特有的毒素合成基因簇序列triA fcr仿设计四对特异性引物RT1/RT2、RTA1/ RTA2、RTB1/RTB2、RTB3/RTB4。用设计的引物对模式菌株的基因组DNA进行扩增。先将引 物稀释成10 Pmol/L。扩增反应体系为50 mL，模板（基因组DNA) :1 mL;引物：各1 mL; 2XGC buffer II :25 mL ;dNTP(2 mM) :1 mL 德：0? 7 mL ;ddH20 :20. 3 mL。扩增条件为 95°C预变性5 min，95°C变性30 s，62°C退火50 s，72°C延伸1 min，30个循环，最后72°C延 伸5 min。扩增结束后，取4mL的扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶90 V /40 min电泳检测。 PCR产物在2. 0%的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pGM-T载体 上，并转化到大肠杆菌DH5 a上，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3个阳 性克隆进行测序，在国际基因库（GenBank)上进行序列分析，验证所得片段并选取效果最好 的扩增片段作为检测探针，RTA1/RTA2扩增的目的片段测序结果稳定正确，扩增的条带大小 符合qPCR所要求的条件，并且没有引物二聚体情况。
[0020] 3、标准曲线建立点的筛选。根据步骤2确定好的反应条件将所提取的孢悬液DNA 稀释成一样的浓度后进行 101，102,4 X 102,8 X 102, 103,4 X 103，6 X 103,8 X 103, 104, 2 X l〇S 4X 104,8X 104，105倍不同梯度稀释。确定反应体系的最低检测浓度。并根据孢悬液和孢悬 液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。
[0021] 4、标准曲线的建立及应用。是根据步骤2和3应用qPCR的反应条件进行标准曲 线的建立，SYBR Green I qPCR反应体系（10 mL)为：PCR Mix :51mL ;引物：各0. 2 mL ;模板 (孢子 DNA):0.2 mL;ddH20:4.4 mL。SYBR Green I qPCR 反应程序：预变性：94°C，5 min; 40个循环：变性：94°C，5 s，复性：62°C，30 s。对样品进行了 12个点的稀释，但由于后面 模板的稀释度越来越大，扩增曲线的线性关系不是很明显，因此，选择了其中线性关系比较 好的五个点做标准曲线。采集接种有CPS-1、CPS-4菌株的土壤中提取的DNA进行检测：每 土壤样品称取5 g加至装有5 ml无菌水的离心管中进行漩涡振荡10 min，静置待土壤颗粒 沉淀后，取上清液离心富集菌体后，用CTAB法提取土壤样品的总基因组DNA，以其为模板进 行qPCR以验证标准曲线的实用性。
【主权项】
1. 马铃薯疮痂致病菌株qPCR技术通用引物的筛选方法，其特征在于：根据NCBI GenBank中已登记的疮痂病菌特有的毒素合成基因簇中的txtA、txtB保守的基因序列设 计，以不同马铃薯疮痂病致病菌株 CPS_1(S. scabies)、CPS_2(S. galilaeus)、CPS_3(S. acidiscabies)、SHXHZ-3 (S. turgidiscabies) -定量抱子 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，筛 选并获得通用qPCR检测引物RTA1/RTA2。2. 根据权利要求1所述的方法，对孢子数进行定量及DNA提取，其特征在于：用平板计 数法将燕麦固体培养基（OMA)上培养的菌株CPS-1 (5： scabies)、CPS-2 (5： 、 CPS-SI^. acii//6icaZ7ie'6i)、CPS-4(5'. 进行计数：将燕麦固体培养基上培 养10 d的疮痂病菌孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行101，102··· 101°倍梯度稀释，取稀释好 的孢悬液50 mL涂布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总 数，用CTAB法提取一定量菌株孢子的基因组DNA。3. 根据权利要求1和2所述的方法，采用的扩增反应条件，其特征在于：先将引物稀 释成10 ymol/L，扩增反应体系为50 mL，模板（基因组DNA) :1 mL;引物：各1 mL;2XGC buffer II :25 mL ;dNTP(2 mM) :1 mL 成每：0· 7 mL ;ddH20 :20. 3 mL ;扩增条件为95°C预变 性5 min，95°C变性30 s，62°C退火50 s，72°C延伸1 min，30个循环，最后72°C延伸5 min， 扩增结束后，取4mL的扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶90 V /40 min电泳检测。4. 根据权利要求2和3所述的方法，对模板进行进行浓度梯度的确定，其特征在于： 将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度后进行10 1，102,4 X 102,8 X 102, 103,4 X 103， 6 X 103,8 X 103, 104, 2 X 104,4 X 104,8 X 104, 105倍不同梯度稀释，确定反应体系的最低检测 浓度，并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。5. 根据权利要求4所述的方法，建立应用标准曲线并进行样品测试，其特征在于：SYBR Green I qPCR 反应体系（10 mL)为：PCR Mix :51mL ;引物：各 0· 2 mL ;模板(孢子 DNA):0. 2 mL;ddH20:4.4 mL;SYBR Green I qPCR 反应程序：预变性：94°C，5 min;40 个循环：变性： 94°C，5 s，复性：62°C，30 s，分别建立不同致病种的标准曲线，利用建立的标准曲线对病 田土壤样品进行检测，证明建立的定量检测方法灵敏度好，可用性高。
【文档编号】C12Q1/68GK106032549SQ201410747149
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月16日
【发明人】于秀梅, 赵伟全, 郭凤柳
【申请人】河北农业大学