一套早期检测苹果果实内潜伏轮纹病菌的组织学方法
【专利摘要】本发明公开了一套早期检测苹果果实内潜伏轮纹病菌的组织学方法，涉及植物组织内病原菌检测领域。本方法适用于调查苹果果实内潜带轮纹病菌的皮孔数量。具体方法为：对于欲检测的苹果果实或果实组织在不低于100℃的温度蒸煮10分钟以上，剥取表皮；剥取的表皮经1%~15%的次氯酸钠透明5~20分钟，1%~30%氢氧化钾或氢氧化钠浸泡3~5分钟，0.1%~3%的苯胺蓝水溶液染色3~5分钟，用20%~80%的甘油作浮载剂制作临时玻片；在荧光显微镜下用315nm~400nm间的紫外光照谢，观测皮孔内面有无被木栓化组织包被的菌丝，从而判定皮孔是否被轮纹病菌侵染。本发明解决果实轮纹病研究中难以及时检测轮纹病菌侵染量问题，为轮纹病菌侵染量的早期检测提供一套简便、可靠的技术方法。
【专利说明】
一套早期检测苹果果实内潜伏轮纹病菌的组织学方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及植物组织内病原菌的观测技术。【背景技术】
[0002]苹果轮纹病是苹果上的重要病害，由子囊菌亚门葡萄座腔菌属spp.)的真菌侵染所致；病菌主要为害果实和枝干，在环渤海湾和黄河故道苹果产区危害尤为严重。
[0003]轮纹病菌侵染果实，导致轮纹病烂果病，严重影响果实的产量和品质，在未套袋果实上，因轮纹病导致的烂果率每年都在5%~30%之间，重病园高达80%以上，因此，轮纹病是苹果果实上的重要病害；在套袋果实上，轮纹病菌主要在套袋前侵染，一般年份的病果率不超过5%，但某些年份个别果园的病果率高达70%。
[0004]苹果轮纹病菌具有潜伏侵染现象，苹果轮纹病菌在苹果落花后就能侵染果实，但病原菌侵染幼果后并不能立即导致果实发病，而是潜伏在果实内，直到8月中旬以后果实才陆续发病。
[0005]由于轮纹病菌侵染果实后存在潜伏侵染现象，在轮纹病的研究中，很难通过接种后观察果实发病率这一常规的方法，研究幼果期轮纹病菌的侵染条件、寄主抗性、防治药剂等等；到目前为止，对于轮纹病菌在苹果幼果期的侵染条件、侵染规律、果实的抗病性还了解很少，病原菌侵染检测已成为限制果实轮纹病研究的瓶颈技术。
【发明内容】
[0006]针对限制果实轮纹病研究的瓶颈问题，本发明的目的在于提供一套早期检测苹果果实内潜伏轮纹病菌的技术方法，解决果实轮纹病研究中难以及时检测轮纹病菌侵染量问题。
[0007]本项发明采用的技术原理如下:轮纹病菌在果实上主要通过气孔和皮孔侵染，病菌侵染时先在皮孔或气孔内生长，形成菌丝和菌落，然后进入皮孔下的寄主组织。病菌侵入皮孔组织后能刺激皮孔下薄壁细胞木栓化，木栓化细胞抑制了的病菌进一步的生长扩展， 使病原菌处于潜伏状态。检查皮孔内有无菌丝，可以判断病菌是否进入皮孔；皮孔内的菌丝和皮孔下的木栓化组织经过处理后，显微镜下清晰可见。检查皮孔下的有无木栓化组织，可以判断轮纹病菌是否侵入皮孔组织内；受侵染皮孔的数量或百分率，就是病菌的侵染量和侵染百分率。
[0008]本发明采用的技术方案如下:对检测果实进行高温蒸煮处理，剥取果实表皮；剥取的表皮经次氯酸钠透明、强碱浸泡、苯胺监染色后，制成临时玻片；在荧光显微镜下经紫外光激发后，观测皮孔外面有无菌丝，从而确定病菌是否进入皮孔；观测皮孔内面有无木栓化的寄主组织，从而确定病菌是否侵入寄主组织。
[0009]具体实施方案如下:(1)取样:用打直径1〇~15毫米的打孔器，打取果实组织，放入试管或三角瓶中，在121°C下处理20分钟，然后用镊子直接剥取果实表皮；(2)次氯酸钠透明:将剥取的果实表皮转入含氯量1%~15%的次氯酸钠溶液中，透明 5~20分钟，直到果皮完全透明后，用蒸馏水漂洗2~3分钟；次氯酸钠溶液的常用浓度为 10% ；(3)强碱处理:把透明的表皮转入1%~30%的氢氧化钾或氢氧化钠水溶液中，浸泡3~5 分钟，再用蒸馏水漂洗2~3分钟；氢氧化钾或氢氧化钠水溶液的常用浓度为12% ;(4)特色性染色:将强碱处理后的果实表皮转入0.1%~3%的苯胺蓝配水溶液中，染色 3~5分钟，用蒸馏水漂洗1~2分钟；苯胺蓝水溶液的常用浓度为0.2% ;(5)制作临时玻片:将染色的果实表皮转到栽玻片上，正面向上，摆放整齐，滴加2~3 滴20%~80%的甘油水溶液作浮载剂，盖上盖玻片，制作临时玻片；常用甘油水溶液的浓度为 50% ；(6)上镜观察:将玻片置于荧光显微镜下，用紫外光激发，紫外光的波长范围 315~400nm先观察表皮外侧的皮孔内有无典型的轮纹病菌菌丝，记录带菌的皮孔数量，即为带有轮纹病菌的皮孔数；然后，取下盖玻片，将表皮反过来，使内面向上，滴加浮载剂后，盖上盖玻片，观察表皮内侧皮孔组织内有无被木栓化组织包被的菌丝，皮孔内面若有木栓化组织包被的菌丝，则该皮孔记为已被轮纹病菌侵染的皮孔。
[0010] 本发明应用效果:应用本项发明技术能在较短的时间内检测出苹果果实上是否带有轮纹病菌，以及带菌数量；轮纹病菌是否侵入皮孔组织内，以及侵入数量；病菌检测不不需要特殊的仪器或设备，所用试剂都是实验室常规试剂。
[0011] 应用实例一:2013年7月上旬，用轮纹病菌分生孢子的孢子悬浮液，浓度为105个孢子/毫升，接种富士苹果果实，果实接种后套塑料袋保湿24小时。接种30天摘取苹果果实，用直径10毫米的打孔器，打取苹果组织，放于三角瓶内，在121°C下蒸煮20分钟，取出后剥取表皮。将剥取表皮放在12%的次氯酸钠溶液中透明10分钟，蒸馏水中漂洗3分钟；再转入10%的氢氧化钾中浸泡5分钟，蒸馏水漂洗2分钟；最后转入0.2%苯胺蓝水溶液染色 3分钟，蒸馏水漂洗1分钟，用50%甘油水溶液作浮载剂制作临时玻片。在荧光显微镜(莱卡 DM2500)下用波长为365nm的紫外光激发，可以看到皮孔内的菌丝发黄绿光的荧光，如图1 所示；皮孔下的木栓化组织发蓝色荧光，有的能看到典型的菌丝结构，如图2,图3和图4所/_J、i 〇
[0012]【附图说明】:图1为10倍的物镜下果实表皮外侧皮孔内轮纹病菌的菌丝；图2为10 倍镜下为果实表皮内侧皮孔内轮纹病菌的菌丝及外围的木栓化组织；图3为20倍物镜下果实表面内侧皮孔内轮纹病菌的菌丝及菌丝外围的皮孔组织；图4为60倍物镜下菌丝外围木栓化的细胞。
【主权项】
1.一套早期检测苹果果实内潜伏轮纹病菌的组织学方法，其特征在于:对于欲检测的 苹果果实或果实组织先进行高温蒸煮处理，剥取表皮；剥取的表皮经次氯酸钠透明、强碱浸 泡、苯胺监染色后，制作临时玻片；在荧光显微镜下经紫外光激发后，观测果实表皮内侧皮 孔内有无被木栓化组织包被的菌丝，从而判定皮孔是否被轮纹病菌侵染，带菌皮孔的数量 或百分率，就是病原菌的侵染量；所述高温蒸煮是用不低于100°c的温度对苹果果实或果实组织蒸煮10分钟以上，实验 室常用12 rc的高温蒸煮20分钟；所述次氯酸钠透明为是将剥取的果实表皮转入含氯量1°/^15%的次氯酸钠(NaC103)溶 液中，透明5~20分钟，直到果皮完全透明后，再用蒸馏水漂洗2~3分钟；次氯酸钠溶液的常 用浓度为12% ;所述强碱浸泡是把透明的表皮转入1%~30%的氢氧化钾(KOH)或氢氧化钠(NaOH)水溶 液中，浸泡3~5分钟，再用蒸馏水漂洗2~3分钟；氢氧化钾或氢氧化钠水溶液的常用浓度为 10% ；所述苯胺蓝染色是将强碱处理后的果实表皮转入〇.1%~3%的苯胺蓝(Aniline blue) 水溶液中，染色3~5分钟，用蒸馏水漂洗1~2分钟；苯胺蓝水溶液的常用浓度为0.5% ;所述制作临时玻片是将染色的果实表皮转到栽玻片上，摆放整齐，滴加2~3滴20%~80% 的甘油水溶液作浮载剂，盖上盖玻片，制作临时玻片；常用甘油水溶液的浓度为50% ;所述紫外光激发是用波长315nm~400nm间的紫外光照谢；所述被木栓化组织包被的菌丝是指轮纹病菌侵入果实的皮孔后，刺激皮孔内的薄壁细 胞木栓化，并包被在菌丝周围，抑制菌丝生长；经紫外光激发后，在荧光显微镜下菌丝发黄 绿荧光，木栓化的组织发出蓝色荧光，结构明显，清晰可见。2.权利要求1所述的一套早期检测苹果果实内潜伏轮纹病菌的组织学方法，其特征 是:果实经高温蒸煮后剥取表皮，经透明、强碱处理、染色、制片后，在荧光显微镜下用紫外 光激发后，观查皮孔内面被木栓化组织包被的菌丝。
【文档编号】C12Q1/04GK106032548SQ201510110688
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月13日
【发明人】李保华, 董向丽, 王彩霞
【申请人】李保华, 青岛农业大学