一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法，属于生物化工领域。该方法包括将三醇组人参皂苷溶解在发酵罐的去离子水中，通N2保护后在线灭菌，然后加有机酸溶液，和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0?30的正整数，N2保护恒温恒压进行定向转化反应，最后收集反应产物进行纯化即可得到高纯度的人参皂苷Rh4。所得的在线灭菌条件为121℃，维持20min，在线灭菌前通N2保护，添加的有机酸为乳酸、苹果酸、柠檬酸、α?酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸或丙酮酸中的一种或几种的组合。本发明工艺简单易行，副反应少，产物纯度高，易于工业化生产。
【专利说明】
一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]人参是应用历史最为久远的名贵药用植物，其药用价值早为世人所公认。人参皂苷作为人参、花旗参、朝鲜参(North Korea ginseng)等五加科人参属植物的主要活性成分，是由不同糖苷与母环通过苷键相连形成的三萜类化合物。由于人参皂苷的结构不同，其表现出的药理作用和临床效果也不尽相同。大量的研究表明，人参皂苷具有抗疲劳、延缓衰老、抑制肿瘤细胞生长、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足等作用，在结抗肿瘤免疫力及抑制肿瘤生长和转移等方面具有重要的作用，具有很大研究空间。国内外学者已对人参皂苷预防和抑制肿瘤的作用进行了深入的研究，在单体人参皂苷抗癌研究中，报道最多的是20(S)_人参皂苷Rh2，其次是20(S)_人参皂苷Rg3。这两种人参皂苷从抑制肿瘤血管生成、降低肿瘤微血管密度、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤转移等方面具有较广泛的抗肿瘤功效。因此，对于Rh4等人参皂苷及其衍生物的研究具有广阔的应用前景和潜在市场价值，在治疗疾病和保护人们的健康方面起着非常重要的作用。
[0003]人参皂苷是人参的标志性成分，是由皂苷元与糖相联构成的糖苷类化合物，含量约4%，可通过五加科植物人参、西洋参、三七、假人参、姜状三七、竹节参等植物提取获得。从1854年开始，中国、日本、美国、俄国、朝鲜等国家的学者就开始了有关人参皂苷的研究，日本学者北川勋于1980年开始陆续从人参中提取得到了人参皂苷20(R)-Rg3、人参皂苷Rh2，并发现对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用。根据目前对人参皂苷系列化合物的研究结果来看，人参皂苷本身结构含有的糖越少，其抗肿瘤活性越好，因此我们联想到人参皂苷Rh4等多种去除一定数量糖苷的人参皂苷都会有良好的抗癌效果。经过对人参皂苷相关专利的检索，查询到专利CN 103193846 A发明了一种人参皂苷Rk3和人参皂苷Rh4顺反异构体的制备方法，涉及人参皂苷Rk3与人参皂苷Rh4顺反异构体的分离方法，产量也仅仅达到毫克水平，尚未发现有人参皂苷Rgl为原料定向转化大规模生产人参皂苷Rh4方法，因为欲得到Rh4等稀有皂苷或皂苷元，通常只有通过降解的办法才能得以实现。通常降解的方法有光降解、酸催化降解、碱催化降解、酶降解、过碘酸裂解(Smith裂解)、化学修饰降解等方法。而人参皂苷在强酸、强碱溶液中降解，生成较多副产物，且成分很复杂，对于后期化合物的分离提纯有一定的影响;酶降解转化具有专一性，不适用于所有的人参皂苷，而且操作要求严格，成本高;而其它降解法过程复杂、成本高、产率低，无法实现大规模生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法。
[0005]本发明的实现过程如下:
一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法，具体包括如下步骤:在发酵罐中，将三醇组人参皂苷溶解于去离子水中，通犯保护后在线灭菌，然后加有机酸溶液和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化剂，其中Y选自P、S1、Fe或Zn，x为3或4，η为0-30的正整数，在70?90 V下反应24?48h，然后静置收集上清液烘干得到目标产物。
[0006]所述的三醇组人参皂苷的纯度大于80%，浓度为50?300g/Lo
[0007]所述的发酵罐装水量不大于发酵罐有效容积的70%。
[0008]所述的灭菌条件为121°C，维持20min，且加热前通N2进行保护。
[0009]所述的通N2保护的通气流速为发酵罐有效容积量的50%/min?200%/min，时间Imin?5min。
[0010]所述的有机酸选自乳酸、苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸；所述的有机酸的浓度为0.01?0.1mol/L。
[0011 ]上述方法制备的目标产物可以利用工业化色谱柱对目标产物精制纯化。
[0012]利用上述方法合成的人参皂苷Rh4原料药制成硬胶囊、软胶囊、片剂、冲剂、滴丸或注射剂。
[0013]本发明的积极效果:本发明综合使用有机酸和杂多酸催化剂，催化效果得到大大提升;本发明采用相对温和的有机酸在生物反应器中的稳定条件下定向转化得到人参皂苷Rh4，将水溶性良好的三醇组人参皂苷定向转化为醇溶性(甲醇溶解)的人参皂苷Rh4，转化率高，收率高，后期精制纯化工艺简单，生产成本低，有利于工业化生产，可显著提高原料药及成品药的市场竞争力。
【附图说明】
[0014]图1为人参皂苷Rgl转化为人参皂苷Rh4的示意图；
图2为人参皂苷Rh4标准品的液相色谱图；
图3为本发明方法生产得到人参皂苷Rh4的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0015]下面给出的实施例，是为了便于理解本发明。并不以任何方式限定本发明的权利要求和核心内容。
[0016]实施例1
将有效容积为100L的全自动发酵罐中加入65L的去离子水，然后加入3500g纯度为85%的人参皂苷Rgl(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通％，通气流量为50L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至90°C以下后，补加浓度为0.15mol/L的无菌柠檬酸溶液5L和1g杂多酸H3PW12O4Q.5H20，然后加热发酵罐内液体至90 °C并维持48h，同时保持搅拌转速为200rpm，反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，收集上清20L并烘干，得到人参皂苷Rh4粗品约3120g，HPLC检测人参皂苷Rh4的纯度为92%。
[0017]对比实例:与上述制备方法类似，不同的是仅使用有机酸或杂多酸，人参皂苷Rh4粗品仅能得到约2000g。
[0018]实施例2
将有效容积为500L的全自动发酵罐中加入300L的去离子水，然后加入90kg纯度为95%的人参皂苷Rg2(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通％，通气流量为350L/min，持续4min，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至90°C以下后，补加浓度为0.8mol/L的无菌苹果酸溶液20L，浓度为0.6mol/L的无菌丁二酸溶液1L和20g杂多酸H4SiW12O4Q.25H20，然后加热发酵罐至75°C并维持36h，同时保持搅拌转速为lOOrpm，反应结束后将所有液体放出静置于容器中24h，离心，得10L上清，底部约有120L固液混合物，再加入120L去离子水，将底部混合物搅拌均匀后，洗涤一次，再静置12h后，离心取上清，收集所得液体并烘干，得到人参皂苷Rh4粗品约82kg，HPLC检测人参皂苷Rh4的纯度为93%。
[0019]实施例3
将有效容积为200L的全自动发酵罐中加入120L的去离子水，然后加入28kg纯度为90%的人参皂苷Rf(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通％，通气流量为200L/min，持续3min，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至90°C以下后，补加浓度为0.3mol/L的无菌苹果酸溶液10L，浓度为0.25mol/L的α-酮戊二酸溶液10L，乳酸225mL和30g杂多酸H3FeW12O4Q.30H20，然后加热发酵罐至90 °C并维持48h，同时保持搅拌转速为300rpm，反应结束后将所有液体放出在容器中静置24h，取上清60L，将剩余底部含有沉淀的液体约40L离心取上清，再加入40L去离子水洗涤一次，将底部混合物搅拌均匀后再静置24h，离心取上清，收集所有上清并烘干，得到人参皂苷Rh4粗品约24kg，HPLC检测人参皂苷Rh4的纯度为92%。
[0020]实施例4
将有效容积为250L的全自动发酵罐中加入150L的去离子水，然后加入50kg纯度为85%的人参皂苷Re(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通％，通气流量为200L/min，持续3min，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至90°C以下后，补加浓度为0.4mol/L的无菌苹果酸溶液10L，浓度为0.4mol/L的α-酮戊二酸溶液10L，乳酸250mL和50g杂多酸H3ZnW12O4Q.25H20，然后加热发酵罐至75°C并维持48h，同时保持搅拌转速为250rpm，反应结束后将所有液体放出在容器中静置24h，取上清60L，将剩余底部含有沉淀的液体约50L离心取上清，再加入50L去离子水洗涤一次，将底部混合物搅拌均匀后再静置12h，离心取上清，收集所有上清并烘干，得到人参皂苷Rh4粗品约41kg，HPLC检测人参皂苷Rh4的纯度为91%。
[0021]实施例5
将有效容积为300L的全自动发酵罐中加入200L的去离子水，然后加入40kg纯度为95%的人参皂苷Rhl(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通％，通气流量为200L/min，持续3min，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至90°C以下后，补加浓度为0.3mol/L的无菌苹果酸溶液10L，浓度为0.3mol/L的α-酮戊二酸溶液10L，乳酸235mL和1g杂多酸H3PW12O4Q.5H20，然后加热发酵罐至90°C并维持48h，同时保持搅拌转速为lOOrpm，反应结束后将所有液体放出在容器中静置24h，取上清约70L，将剩余底部含有沉淀的液体约60L离心取上清，再加入60L去离子水洗涤一次，将底部混合物搅拌均匀后再静置24h，离心取上清，收集所有上清并烘干，得到人参皂苷Rh4粗品约38kg，HPLC检测人参皂苷Rh4的纯度为94%。
【主权项】
1.一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rh4的方法，其特征在于:在发酵罐中，将三醇组人参皂苷溶解于去离子水中，通犯保护后在线灭菌，然后加有机酸溶液和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化剂，其中Y选自P、S1、Fe或Zn，x为3或4，n为0-30的正整数，在70?90 V下反应24?48h，然后静置收集上清液烘干得到目标产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的三醇组人参皂苷的纯度大于80%，浓度为50?300g/Lo3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的发酵罐装水量不大于发酵罐有效容积的70%。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的灭菌条件为121°C，维持20min，且加热前通N2进行保护。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述的通犯保护的通气流速为发酵罐有效容积量的 50%/min?200%/min，时间 Imin?5min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的有机酸选自乳酸、苹果酸、柠檬酸、 酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸;所述的有机酸的浓度为0.01?0.lmol/L。7.根据权利要求1至6所述的方法，其特征在于:利用工业化色谱柱对目标产物精制纯化。8.利用权利要求1所述的方法合成的人参皂苷Rh4原料药制成硬胶囊、软胶囊、片剂、冲剂、滴丸或注射剂。
【文档编号】A61K9/20GK106046096SQ201610346432
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】范代娣, 惠俊峰, 段志广, 马沛, 朱晨辉, 马晓轩, 李伟娜, 米钰
【申请人】西北大学