驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物及制备方法和用图
【专利摘要】本发明涉及一种驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物及制备方法和用途，该化合物的为斑鸠菊大苦素二聚体 I，斑鸠菊大苦素二聚体 J和斑鸠菊大苦素二聚体 K，采用将粉粹的驱虫斑鸠菊种子，用石油醚渗漉脱脂得到总提取物，然后用石油醚/乙酸乙酯，氯仿/甲醇，甲醇/水分别梯度洗脱，再用半制备高效液相色谱仪反复进行纯化，经过波谱和质谱数据分析表明从驱虫斑鸠菊种子中分离得到三个新的倍半萜二聚体类化合物斑鸠菊大苦素二聚体 I,J和K。经体外抗肿瘤活性研究表明，所提供的化合物对人肺癌细胞A?549、人结肠癌细胞HCT?15和人前列腺癌细胞PC?3具有较明显的细胞毒活性，可应用于天然的低毒抗肿瘤药物，从而为研制抗肿瘤药物提供了新的先导化合物。
【专利说明】
驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物及制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一类从维药驱虫斑鸠菊种子中分离纯化得到的具 有抗肿瘤活性的倍半萜二聚体类新化合物斑鸠菊大苦素二聚体I，J和K及其制备方法和用 途。
【背景技术】：
[0002] 驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica(L. )willd.)为一年生高大草本，莖直立， 高达60厘米。此种据文献记载只见于巴基斯坦、印度、斯里兰卡、尼泊尔、阿富汗、马来西亚 等国，在中国分布于云南西部，在新疆南部的阿克苏、和田有栽培。《中华人民共和国卫生部 药品标注维吾尔药分册》中记载，本品属于三级干热，主要功能与主治为清除异常粘液质、 驱虫、消肿、散寒止痛。常用于湿寒性胃痛及肝病，白癜风等。
[0003] 有关驱虫斑鸠菊的化学成分研究主要集中在种子油部分以及提取物，除去油之后 部分的化学成分研究并不多。查阅国内外文献发现，从驱虫斑鸠菊中分离得到的脂肪酸及 其酯类除外的化合物类型主要包括倍半萜内酯类、黄酮类、三萜类、留体类、咖啡酰基奎宁 酸类等。
[0004] 迄今对驱虫斑鸠菊的倍半萜类成分研究不多，总共分离得到8个，从驱虫斑鸠菊种 子分离得到的4个倍半萜类均为榄香内酯类，其中两个是刘永强等分离得到的罕见的榄香 内酯类二聚体斑鸠菊大苦素二聚体A和斑鸠菊大苦素二聚体B，这两个二聚体类化合物对急 性粒细胞白血病细胞HL-60有很强的抑制活性。另外两个是榄香内酯类的倍半萜，分别为 Asaka，Y等分离得到的斑鸠菊醇(Vernodalol)和吴剑飞等首次从驱虫斑鸠菊中分离得到的 斑鸠菊大苦素(Vernodalin) aZhang Li等从驱虫斑鸠菊的地上部分分离得到了2个新的愈 创木烷型倍半萜类化合物（11?，41?，55,61?，71?，85)-8，15-二羟基愈创木烷-10(14)，11(13)-二烯 12,6-内酯和（11?，41?，53,61?，71?，83，113)-8，15-二羟基愈创木烷-10(14)-烯-6，12-内 酯以及已知榄香内酯类倍半萜(45,51?，61?，71?，85，101?，115)-11，13-二羟基斑鸠菊内酯。
[0005] 目前，国内外抗肿瘤药物主要为化学合成药物，虽然具有一定疗效，但对肿瘤的远 期效果较差，并且毒副作用较大;与之相比，中草药治疗肿瘤体现多方面的优势，以其疗效 独特、毒副作用小、开发潜能巨大而引起广泛关注。从中药及天然药物资源中寻找和发现高 效、低毒、结构独特的抗肿瘤药物成为一条有效的途径。据文献报道，从天然分离得到的通 过酶促狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应形成的倍半萜二聚体类化合物有几百个，表现出 较为广泛的生物活性，其中尤以抗肿瘤活性为研究热点，该类化合物也表现出较好的抗肿 瘤活性。
[0006] 本发明目的在于，从维药驱虫斑鸠菊种子中寻找具有抗肿瘤活性的物质，为研制 抗肿瘤药物提供新的先导化合物，为开发我国民族药用资源提供科学依据。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于，提供一种驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物及制备方法 和用途，该方法首先将粉粹的驱虫斑鸠菊种子，用石油醚渗漉脱脂得到总提取物，然后用石 油醚/乙酸乙酯，氯仿/甲醇，甲醇/水分别梯度洗脱，再用半制备高效液相色谱仪反复进行 纯化，经过波谱和质谱数据分析表明从驱虫斑鸠菊种子中分离得到三个新的倍半萜二聚体 类化合物斑鸠菊大苦素二聚体I(vernodalidimer I)，斑鸠菊大苦素二聚体J <>61'110(1311(1；[11161'】)和斑鸠菊大苦素二聚体1((>61'110(1311(1；[11161'10。将得到的化合物斑鸠 菊大苦素二聚体I，J和K经体外抗肿瘤活性研究表明，所提供的三个倍半萜二聚体化合物对 人肺癌细胞A-549、人结肠癌细胞HCT-15和人前列腺癌细胞PC-3具有较明显的细胞毒活性， 可以应用于开发来自天然的低毒抗肿瘤药物，从而为研制抗肿瘤药物提供了新的先导化合 物。
[0008] 本发明所述的一种驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物，该化合物结构式为：
[0009]
[0010] 其中：结构式1为斑鸠菊大苦素二聚体I，结构式2为斑鸠菊大苦素二聚体J，结构式 3为斑鸠菊大苦素二聚体K。
[0011] 所述的驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物的制备方法，按下列步骤进行：
[0012] a、将粉粹的驱虫斑鸠菊种子，用10倍量石油醚渗漉脱脂，药渣晾干，用10倍量体积 比1:1:1的石油醚:乙醚：甲醇渗漉提取，提取液减压回收溶剂，得到总提取物；
[0013] b、将步骤a得到的提取物，上硅胶柱，按体积比为100:0，100:10，100:40，100:70， 100:100，50:100，0:100的石油醚：乙酸乙酯依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的 流份，得到流份A-J;
[0014] c、取步骤b中的流份F，上硅胶柱，按体积比为100 :0，100: 2，100: 5，100 :10，100 : 50,100:100的氯仿：甲醇，依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流份，得到流份 F1-F6；
[0015] d、取步骤c中的流份F2,上flash快速制备系统，用反向C18色谱柱，按体积浓度为 40 %，55 %，70 %，85 %的甲醇:水进行梯度洗脱，检测波长210nm，根据紫外吸收色谱图进行 合并，得到流份F21-F26;
[0016] e、取步骤d F24中的体积浓度为60 %-80 %的甲醇:水洗脱部位，用凝胶柱色谱，以 甲醇为洗脱剂洗脱，用薄层色谱检识，合并相同斑点的流份；
[0017] f、取步骤e中分子量较大且薄层色谱上有明显灰色斑点的部位，即第二个流份，用 半制备高效液相色谱仪反复进行纯化，高效液相色谱纯化条件为25 % -40 %乙腈:水，流速 2.5-3ml/min，检测波长210nm，按色谱图收集，真空干燥后，经高分辨质谱以及一维和二维 核磁鉴定，得到化合物斑鸠菊大苦素二聚体I，斑鸠菊大苦素二聚体J和斑鸠菊大苦素二聚 体K 〇
[0018] 步骤d中反向C18色谱柱收集体积浓度为60 % -80 %的甲醇:水部位。
[0019] 所述的驱虫斑鸠菊中的倍半萜二聚体类化合物在制备抗肿瘤人肺癌细胞A-549、 人结肠癌细胞HCT-15和人前列腺癌细胞PC-3活性中的用途。
[0020] 通过本发明所述方法获得的化合物斑鸠菊大苦素二聚体I，斑鸠菊大苦素二聚体J 和斑鸠菊大苦素二聚体K，按常规经核磁共振(NMR)、高分辨质谱(HR-ESI-MS)、电子圆二色 谱(ECD)、红外（IR)等多种现代光谱技术，以及计算电子圆二色谱鉴定，斑鸠菊大苦素二聚 体I，J和K为倍半萜二聚体类新化合物。
[0021] 通过本发明所述方法获得的化合物斑鸠菊大苦素二聚体I、斑鸠菊大苦素二聚体J 和斑鸠菊大苦素二聚体K，经体外抗肿瘤活性试验表明，化合物斑鸠菊大苦素二聚体I，J和K 对人结肠癌细胞HCT-15、人前列腺癌细胞PC-3、人肺癌细胞A549均具有细胞毒活性，可用于 制备抗肿瘤药物。
[0022]本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利用维药资源具有 重要意义。
【附图说明】
[0023]图1为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体I的结构；
[0024]图2为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体J的结构；
[0025] 图3为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体K的结构；
[0026] 图4为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体I的高分辨质谱图。
[0027] 图5为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体I的核磁共振氢谱。
[0028] 图6为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体I的核磁共振碳谱。
[0029] 图7为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体I的实验和计算圆二色谱图。
[0030] 图8为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体J的高分辨质谱图。
[0031 ]图9为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体J的核磁共振氢谱。
[0032] 图10为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体J的核磁共振碳谱。
[0033] 图11为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体J的实验和计算ECD图谱。
[0034]图12为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体K的高分辨质谱图。
[0035] 图13为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体K的核磁共振氢谱。
[0036] 图14为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体K的核磁共振碳谱。
[0037] 图15为本发明中斑鸠菊大苦素二聚体K的实验和计算圆二色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 以下结合实施例对本发明作详细描述，但并不仅限于所给出的实施例。
[0039] 实施例1.制备化合物斑鸠菊大苦素二聚体I、斑鸠菊大苦素二聚体J和斑鸠菊大苦 素二聚体K:
[0040] 制备驱虫斑鸠菊提取物浸膏：
[0041] a、将粉粹的驱虫斑鸠菊种子15Kg，用10倍量石油醚150L渗漉脱脂，药渣晾干，再用 10倍量体积比1: 1:1的石油醚：乙醚：甲醇150L渗漉提取，提取液减压回收溶剂，得到总提取 物浸膏457g;
[0042] 分离纯化：
[0043] b、将步骤a得到的浸膏，用氯仿：甲醇混合溶剂溶解，与500g硅胶（100-200目）拌 样，上硅胶柱，按体积比为 100:0，100:10，100:40，100:70，100:100，50:100，0:100 的石油 醚:乙酸乙酯依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流份，得到流份A-J;
[0044] c、取步骤b中的流份F( 132.6g)与135g硅胶（100-200目）拌样，上硅胶柱，按体积比 为100:0，100: 2，100: 5，100:10，100:50，100:100的氯仿：甲醇，依次梯度洗脱，薄层色谱检 识，合并相同斑点的流份，得到流份F1-F6;
[0045] d、取步骤c中的流份F2，上flash快速制备系统，用反向Cis色谱柱，按体积比为 40 %，55 %，70 %，85 %的甲醇:水进行梯度洗脱，检测波长210nm，根据紫外吸收色谱图进行 合并，得到流份F21-F26;
[0046] e、取步骤d F24中的60%_80%甲醇：水洗脱部位，用凝胶（sephadex LH-20)柱色 谱，以甲醇为洗脱剂洗脱，用薄层色谱检识，合并相同斑点的流份；
[0047] f、取步骤e中分子量较大且薄层色谱上有明显灰色斑点的部位，即第二个流份，用 半制备高效液相色谱仪反复进行纯化，高效液相色谱纯化条件为25 % -40 %乙腈:水，流速 2.5-3ml/min，检测波长210nm，按色谱图收集，真空干燥后，经高分辨质谱以及一维和二维 核磁鉴定，得到化合物斑鸠菊大苦素二聚体I(2.5mg)、斑鸠菊大苦素二聚体J(1.9mg)和斑 鸠菊大苦素二聚体K(9. Omg)。
[0048]结构鉴定
[0049] 按常规经核磁共振(匪R)、高分辨质谱（HR-ESI-MS)、电子圆二色谱（E⑶）、红外 (IR)等多种现代光谱技术，以及运用计算圆二色谱确定斑鸠菊大苦素二聚体I，J和K的化学 结构及立体构型，其中斑鸠菊大苦素二聚体I的立体构型为SSjSJSJRJOSJlRjYj' 5,7/1?，8 /1?，10/1?;斑鸠菊大苦素二聚体了的立体构型为55,65,75,81?，105，111?，5 /5,6/5,7/ 尺，8/1?，10/1?;斑鸠菊大苦素二聚体1(的立体构型为53,63,71?，81?，103,5 /1?，6/1?，7/3,8/1?，10/ R，17，S。
[0050]斑鸠菊大苦素二聚体Ι:[α]〖° =+32. 7 (c〇. 〇5，甲醇)6UV(甲醇)λΜ nm(l〇ge) = 202(2.56)<JR(KBr)umax cm-^3447,2951,1717,1628,1441,1159,1051( + )^451-]^给 出m/z 739.2954[M+H] +，（计算值为C39H47〇i4 739.2966)，确定分子式为C39H46〇i4。经过核磁 共振氢谱Gh-nmr)、核磁共振碳谱( 13C-NMR)、质子相关谱(4-? COSY)、梯度场异核单量子 相关谱(gHSQC)、异核多键相关(HMBC)和二维核奥弗豪泽效应谱(N0ESY)的综合解析，确定 斑鸠菊大苦素二聚体I的结构，为一种新的化合物。核磁共振氢谱(氘代氯仿，600MHz)和核 磁共振碳谱(氘代氯仿，150MHz)数据见表1。
[0051 ]表1斑鸠菊大苦素二聚体I的核磁共振数据
[0052]
[0053]
[0054]
[0055] 其中d:表示二重峰，s:表示单峰，br s:表示宽单峰，m:表示多重峰。
[0056] 斑鸠菊大苦素二聚体J:U]i°二+645 (C0.Q8，甲醇)。叭（甲醇)λΜ nm(l〇ge) =202(3.31)。1以0〇〇· cm-^3447(羟基），1717和 1647(酯羰基），1636(双键）。（+ )·-ESI-MS给出[M+H] +峰m/z : 739 · 2958，（计算值为C39H47〇i4 739 · 2965)，确定分子式为 C39H46〇i4。经过核磁共振氢谱Gh-nmr)、核磁共振碳谱(13C-NMR)、质子相关谱(4-?⑶SY)、 梯度场异核单量子相关谱(gHSQC)、异核多键相关(HMBC)和二维核奥弗豪泽效应谱(N0ESY) 的综合解析，确定斑鸠菊大苦素二聚体J的结构，为一种新的化合物核磁共振氢谱(氘代氯 仿，600MHz)和核磁共振碳谱(氘代氯仿，150MHz)数据见表2。
[0057] 表2斑鸠菊大苦素二聚体J的核磁共振数据
[0058]
[0059]
[0060] 其中d:表示二重峰，s:表示单峰，br s:表示宽单峰，m:表示多重峰。
[0061] 斑鸠菊大苦素二聚体K:[a]f = +45. 5 (c 0.23，甲醇hUV(甲醇)λ"Μ nm(l〇g〇 =201(2.98)。（ + 迮51-]\^给出111/2 771[]\1+!1]+，793[]\1+恥]+，提示分子量为770。（ + )服451-]^ 给出[M+H]+峰m/z : 771 · 2866，（计算值为C39H47〇i6 771 · 2864)，确定分子式为C39H46〇i6。IR (KBr)提示有羟基(3435cm-酯羰基（1718cm-双键（1625cm-4等基团。经过核磁共振氢 谱(h-NMR)、核磁共振碳谱( 13C-NMR)、质子相关谱(4-? COSY)、梯度场异核单量子相关谱 (gHSQC)、异核多键相关(HMBC)和二维核奥弗豪泽效应谱(N0ESY)的综合解析，确定斑鸠菊 大苦素二聚体K的结构，为一种新的化合物。核磁共振氢谱(氘代氯仿，600MHz)和核磁共振 碳谱(氘代氯仿，150MHz)数据见表3。
[0062] 表3斑鸠菊大苦素二聚体K的核磁共振数据
[0063]
[0064]
[0065] 共〒cl:衣不一里iu幸，s:衣不平iu幸，or s:衣不瓦平iu幸，m:衣不多里iu幸。
[0066] 实施例2体外抗肿瘤活性实验：
[0067] 实验方法:将本发明获得的化合物斑鸠菊大苦素二聚体I、斑鸠菊大苦素二聚体J 和斑鸠菊大苦素二聚体K进行体外肿瘤细胞的细胞毒活性试验，试验方法采用常规的噻唑 蓝(MTT)法；
[0068] 肿瘤细胞株:HCT-15(人结肠癌细胞）；PC-3(人前列腺癌细胞）；A549(人肺癌细 胞），由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供；
[0069] 实验试剂、耗材和仪器:噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMS0)，购买于美国Sigma公司； DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基，购买于美国Gibco公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清，购 买于美国Hyclone公司；
[0070]实验用药:化合物斑鸠菊大苦素二聚体I、斑鸠菊大苦素二聚体J和斑鸠菊大苦素 二聚体K，由实施例1制备，配成浓度为10mM的二甲基亚砜溶液，临用前稀释；
[0071] 细胞培养:A549和PC-3细胞在DMEM/F12培养基中培养，HCT-15细胞培养于RPMI -1640培养基中，按照常规培养，四种细胞培养基中分别加入10%的胎牛血清(FBS)和1个单 位的抗生素混合物（1 X l〇5U/L的青霉素和100mg/L的链霉素），并置于温度37°C、5%二氧化 碳/95 %空气的细胞培养箱中培养3-4天；
[0072] 细胞毒活性测试:将处于对数生长期的人肺癌细胞A-549、人结肠癌细胞HCT-15和 人前列腺癌细胞PC-3均以5X 103个/孔的密度分别接种于96孔微量培养板内，置于温度37 °C、5 %二氧化碳和95 %湿度的细胞培养箱中培养24小时后，吸出原培养基，加入不同体积 浓度梯度（1，10，25，50，75，100μΜ)的样品溶液，体积为lOOyL/孔，对每个细胞株、每个浓度 均设置三个复孔，另设无细胞调零孔、有细胞不含药物对照组及阳性药物对照孔，在温度37 °C、5 % C02条件下培养48小时后，每个孔中分别加10yL的噻唑蓝（5mg/mL)溶液，继续培养4 小时;弃上清液，每个孔加入150yL二甲基亚砜，在摇床上摇10分钟，待结晶溶解后，在570nm 波长下用酶标仪测定光密度(0D)值。然后计算药物对不同癌细胞生长的抑制率以及半数抑 制量IC5〇值。
[0073] 按下列公式计算不同浓度样品对细胞的抑制率：
[0074]
[0075] 实验结果:斑鸠菊大苦素二聚体I，J和K以及阳性对照药阿霉素的试验结果见表4。 [0076]表4.斑鸠菊大苦素二聚体I，J和K以及阿霉素对肿瘤细胞的1(： 50值
[0077]
[0078] 实验结果表明：化合物斑鸠菊大苦素二聚体I、斑鸠菊大苦素二聚体J和斑鸠菊大 苦素二聚体K对人肺癌细胞A-549、人结肠癌细胞HCT-15、人前列腺癌细胞PC-3具有较明显 的细胞毒活性，因此可以用于制备抗肿瘤药物或作为抗肿瘤药物的先导化合物。
【主权项】
1. 一种驱虫斑鸠菊中的倍半祗二聚体类化合物，其特征在于该化合物结构式为：其中：结构式1为斑鸠菊大苦素二聚体I，结构式2为斑鸠菊大苦素二聚体J，结构式3为 斑鸠菊大苦素二聚体K。2. -种如权利要求1所述的驱虫斑鸠菊中的倍半祗二聚体类化合物的制备方法，其特 征在于按下列步骤进行： a、 将粉粹的驱虫斑鸠菊种子，用10倍量石油酸渗漉脱脂，药渣惊干，用10倍量体积比1: 1:1的石油酸:乙酸：甲醇渗漉提取，提取液减压回收溶剂，得到总提取物； b、 将步骤a得到的提取物，上硅胶柱，按体积比为100:0，100:10，100:40，100 :70，100: 100，50:100，0:100的石油酸：乙酸乙醋依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流 份，得到流份A-J; C、取步骤b中的流份F，上硅胶柱，按体积比为100 :0，100 : 2，100 : 5，100 :10，100 : 50， 100:100的氯仿：甲醇，依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流份，得到流份F1- F6； d、 取步骤C中的流份F2，上f lash快速制备系统，用反向Ci8色谱柱，按体积浓度为40%， 55% ,70% ,85%的甲醇:水进行梯度洗脱，检测波长210nm，根据紫外吸收色谱图进行合并， 得到流份F21-F26; e、 取步骤d F24中的体积浓度为60% -80 %甲醇:水洗脱部位，用凝胶柱色谱，W甲醇为 洗脱剂洗脱，用薄层色谱检识，合并相同斑点的流份； f、 取步骤e中分子量较大且薄层色谱上有明显灰色斑点的部位，即第二个流份，用半制 备高效液相色谱仪反复进行纯化，高效液相色谱纯化条件为25%-40%乙腊:水，流速2.5- 3ml/min，检测波长210加1，按色谱图收集，真空干燥后，经高分辨质谱W及一维和二维核磁 鉴定，得到化合物斑鸠菊大苦素二聚体I、斑鸠菊大苦素二聚体J和斑鸠菊大苦素二聚体K。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤d中反向Ci8色谱柱收集体积浓度为 60 % -80 %的甲醇:水部位。4. 根据权利要求1所述的驱虫斑鸠菊中的倍半祗二聚体类化合物在制备抗肿瘤人肺癌 细胞A-549、人结肠癌细胞HCT-15和人前列腺癌细胞PC-3活性中的用途。
【文档编号】A61K31/366GK106083882SQ201610387850
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月4日 公开号201610387850.0, CN 106083882 A, CN 106083882A, CN 201610387850, CN-A-106083882, CN106083882 A, CN106083882A, CN201610387850, CN201610387850.0
【发明人】阿吉艾克拜尔·艾萨, 阿不拉江·图拉克
【申请人】中国科学院新疆理化技术研究所