去甲斑蝥素单酸单酯衍生物及其抗肿瘤应用
【专利摘要】本发明提供了一种去甲斑蝥素单酸单酯衍生物及其应用，其结构式如式3所示，其中，R选自C1?C3的烷基或苄基。活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3对于肝癌、胃癌及结肠癌三种肿瘤细胞具有良好的抑制活性，可望应用于制备上述三类抗肿瘤药物。
【专利说明】
去甲斑蝥素单酸单酯衍生物及其抗肿瘤应用
技术领域
[0001] 本发明属于新药设计与合成领域，具体涉及一类新型去甲斑蝥素单酸单酯衍生物 及其抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 斑蝥，也写作斑蟊，俗称班苗、西班牙苍蝇等，在我国现存最早的中药学专著《本草 纲目》、《神农本草经》等中都曾有记载。斑蝥是芫菁科昆虫南方大斑蟊或黄黑小斑蟊的干燥 体，属鞘翅目芫菁科昆虫，是我国最早发现的具有抗癌作用的药材之一。斑蝥性辛，热，具有 很强的肾毒性，同时具有破血逐瘀、去除淤积，消肿以及攻毒蚀疮的功效，临床常用于恶疮， 顽癣，狂犬病及癌症肿痛等的治疗。
[0003] 而后的研究表明，斑蝥的体内含有一种倍半萜类衍生物，称之为斑蝥素 (cantharidin，Ci〇Hi2〇4)，具有较高的抗癌活性，具有非常高的药用价值。斑蜜素为无色结 晶，不溶于冷水，微溶于热水，溶于丙酮和氯仿。斑蝥素主要存在于多种昆虫中，能使人体皮 肤起疱，斑蝥素及其衍生物抗肿瘤的机制主要是抑制蛋白质与酸的合成，增强机体对肿瘤 细胞的杀伤力而达到治疗目的。斑蝥素及其类似物对肝癌，卵巢癌，食道癌等有良好的疗 效，它是通过改变蛋白质的活性，抗肿瘤侵袭转移，引起细胞周期阻滞，抑制肿瘤生长，从而 使得其死亡。其抗肿瘤的机制为通过减少癌细胞对氨基酸的摄取，抑制蛋白质的合成，刺激 淋巴细胞、巨噬细胞、多形核细胞产生白细胞介素，从而提高机体免疫力，同时杀伤肿瘤细 胞而达到治疗目的，与其他的抗肿瘤药物相比，斑蝥素及其衍生物有许多优点:其在抑制肿 瘤的同时，不仅没有免疫抑制的副作用，还能提升机体白细胞等。
[0004] 但斑蝥素对泌尿系统和肠胃系统有较大的毒副作用，斑蝥素既是抗肿瘤的活性成 分，同时也是毒性的主要成分。对其进行恰当的结构修饰，会在保留其抗肿瘤活性的基础 上，大大减低对机体的毒副作用，以去甲斑蝥素衍生物的合成为例。去甲斑蝥素不但保留了 其较强的抗肿瘤活性和升高白细胞的作用，还消除了其对泌尿系统的副作用，后来，以去甲 斑蝥素为先导化合物进行结构改造成为了研究的热点。这种优势在抗肿瘤药物中还是少见 的，所以引起了广泛的关注，陆续合成了许多减少其毒副作用但同时又保留其活性的同类 药物，开发更新高效低毒的衍生物是一个很好的研究方向。
[0005] 对斑蝥素进行结构修饰后用于治疗癌症的衍生物近年来陆续的出现，并开始运用 于临床治疗。如去甲斑蝥素，它比斑蝥素少了两个甲基，其毒性明显减低，而治疗作用却优 于斑蟊素。
[0006] 目前，斑蝥素和去甲斑蝥素都已经应用在临床中，这两个药物都各具有临床特点， 但不足之处是:这两个药物的水溶性都较差，生物利用度不高。从化学结构中看出，斑蝥素 和去甲斑蝥素的结构中均包含了分子内酸酐结构。而斑蝥酸即斑蝥素化合物的酸酐水解后 得到的二元羧酸化合物;斑蝥酸还未被开发成为药物，仅仅是报道了其结构式。
[0007]
[0008] 此外，临床上还研宄了斑蝥素钠，去甲斑蝥素钠，甲基斑蝥胺等，这些结构改造均 将斑蝥素及去甲斑蝥素的内酸酐环打开，以开环方式存在，从化学结构上看;对应的开环化 合物其相应的溶解度较大，其体内生物利用度也高。对斑蝥素的结构进行修饰，寻找高效低 毒的斑蝥素抗肿瘤药物，具有重要的工业应用价值和广泛的市场前景。申请号为 21^201410163619.4、21^201410163711.0、21^01410163705.5的中国专利公开了制备去甲基 斑蝥素酸盐的方法，迄今，尚未有报道设计并合成开环的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物结构 及合成方法。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型去甲斑蝥素单酸单酯衍 生物、其合成方法及其抗肿瘤应用。
[0010] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0011] -方面，本发明提供了一种新型的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物，其结构式如式3所 示，
[0012]
[0013] 其中，R选自C1-C3的烷基或苄基。所述R更优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、苄基。
[0014] 另一方面，本发明提供了如上所述的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3的合成方法，包 括以下步骤：1)、5_烯去甲斑蝥素在有机溶剂中在催化剂存在下加氢还原得到去甲斑蝥素 2,2)、去甲斑蝥素2与相应的醇(R0H)反应得到去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3;合成路线为：
[0015]
[0016]上述合成路线中，醇R0H中R基团的选取同上述式3所示化合物结构中相应R基团的 选取相同。
[0017] 上述合成方法中，所述步骤1)的催化齐lj选自Pd/C，Pd(0H)2/C，Pt/C或Raney Ni等 氢化催化剂;所述步骤1)的催化剂优选Pd/C或Pd(0H)2/C。
[0018]上述合成方法中，所述步骤2)的醇R0H选自选自C1-C3的烷基或苄基;更优选为甲 醇、乙醇、丙醇、异丙醇、苄醇。
[0019] 在上述合成路线中，有机溶剂可以依据反应对温度、溶剂极性的需求，从N，N_二甲 基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃或乙醚中选择。
[0020] 例如，所述步骤1)的采用的反应溶剂为醚类溶剂、卤代烃或醇类溶剂，例如：乙醚、 丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、甲醇或乙醇等。
[0021] 所述步骤2)中采用的反应溶剂可以为相应的醇溶剂或者是卤代烃溶剂，例如：二 氯甲烷、氯仿等。
[0022] 活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3对肝癌、胃 癌及结肠癌三种肿瘤细胞具有良好的抑制活性。因此，本发明的第三方面提供了去甲斑蝥 素单酸单酯衍生物3用于制备抗肝癌、胃癌及结肠癌三种肿瘤的药物中的用途。
[0023] 术语
[0024]本文中的缩写具有以下含义:小时缩写为h，分钟缩写为min;四氢呋喃缩写为THF， N，N-二甲基甲酰胺缩写为DMF、二甲基亚砜缩写为DMS0;在合成实施例中Μ代表mol/L。
【具体实施方式】
[0025]以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。 在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪 器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。本发明中使用的呋喃，顺丁烯二酸酐等试剂均来自上海国药集团；所用溶剂 来自遵义双巨化工有限公司。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。
[0026]合成路线为：
[0027]
[0028] 上述合成路线的各步骤反应，可以用色谱法、液质连用谱来监控反应进程。色谱法 中，可适用薄层色谱TLC还可用气相色谱法或液相色谱法如HPLC代替等。
[0029]实施例1. 5-烯去甲斑蝥素1的制备
[0030]从试剂瓶中取出一定量的顺丁烯二酸酐，置于干燥的研体中研细，再用电子天平 称取研细的顺丁烯二酸酐12.021g，置于干燥的三口烧瓶中，塞上塞子，再加乙醚搅拌，在乙 醚量为90mL时顺丁烯二酸酐完全溶解。待顺丁烯二酸酐完全溶解后，用滴液漏斗缓慢加入 13mL呋喃，用时13min。控制温度在38 °C开始反应。反应lh后溶液出现白色固体，且时间越长 白色固体越多。反应至24h后抽滤，得白色固体的化合物1，即5-烯去甲斑蝥素。干燥称重为 17.46g，收率85.8%。熔点：122~123°C，比移值Rf :0.52(展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3: 1);屯匪1?(〇0(：13):3:3.18(8,2!〇,5.47(8,2!〇,6.58(8,2!〇。
[0031]实施例2.去甲斑蝥素2的制备
[0032] 取5-烯去甲斑蝥素1 (1.091g)于施兰克瓶中，加入20ml四氢呋喃使其溶解，加入 109mg钯碳，真空除去烧瓶中空气后通入氢气，25°C下搅拌使其反应，反应结束后抽滤除去 钯碳，将所得滤液旋蒸，干燥，即得去甲斑蝥素（72.2 % )，白色固体794.311^。1!1匪1?(0150-de) ：5：4.85(s,2H) ,3.34(d,J = 20Hz,2H) ,1.65(d,J = 8Hz,4H) 〇13CNMR(DMS0-d6) ：δ： 173·35,80·08,51·14,40·35,40·14,39·93,39·72,27·90。
[0033]实施例3.去甲斑蝥素单酸乙酯(3，R = Et)的合成：
[0034] 步骤:取去甲斑蝥素 672mg于烧瓶中，加入30ml无水乙醇使其溶解，80°C加热回流， 4.5小时后反应完全，旋蒸，以乙酸乙酯为洗脱液过硅胶柱，点板，收集显色的样品旋蒸，干 燥，即得去甲斑蝥素单酸乙酯（87%)，白色固体747.21^。咕匪1?(0)(：13)上4.91((1，了 = 24Hz，2H)，4.11(d，J = 8Hz，2H)，2.99(q，J = 12Hz，3H)，1.81(t，J = 4Hz，2H)，1.52(d，J = 8取，2!〇，1.21(^ = 8!^，3!1)。13(：匪1?(0)(：13):3:176.45，170.87,78.59,78.29,77.03， 76.71，61.16,52.27,28.97，13.94。
[0035]实施例4.去甲斑蝥素单酸甲酯(3，R=Me)的合成：
[0036] 称取去甲斑蜜素503.6mg(3mmol)，溶于5ml甲醇中，加热到80°C~85°C，冷却回流， 反应3.5h后放置冰箱中冷却12h，析出无色固体，抽滤，得到去甲斑蝥素单酸甲酯产物 145.211^(0.725臟〇1)，产率24.2%， 1!1匪1?(015〇-(16):3:12.22(8，1!〇,4.66(8,2!〇,3.49(8， 3H)，2 · 98(s，2H)，1 · 48-1 · 54(m，4H) · 13C匪R(DMS〇-d6): δ : 172 · 72，172 · 04，78 · 26，77 · 93， 76.71，61.16,52.27,28.97，13.94。
[0037]实施例5.去甲斑蝥素单酸苄酯(3，R = Bn)的合成：
[0038] 取去甲斑蝥素 200mg( 1.19mmol)，置于圆底烧瓶中，加入4ml二氯甲烷溶解，后加入 0.17ml三乙胺和0.13ml苄醇（1.2mmol)，反应lh后，在160°C加热回流5h，冷却后，减压除去 溶剂，将剩余物经柱层析得到固体产物162.4mg，产率49.4 %，iHNMI^DMSO-cb): δ: 12.29 (s， 1Η) ,7.29-7.34(m,5H),5.01(d,J=16Hz,lH),4.99(d,J=12Hz,lH),4.69(t,J = 4Hz,2H), 3.03(d,J = 4Hz,2H) ,1.49-1.53(m,4H) .13CNMR(DMS0-d6)：5：172.76,171.49,136.17, 128.79,128.37,128.35,127.46,127.31,78.35,78.01,66.06,52.41,51.34,28.95,28.93.
[0039] 实验例6.去甲斑蝥素单酸单酯3的抗肿瘤活性测试
[0040] 细胞株和溶剂 [0041 ] 人肝癌细胞HEPG2，
[0042] 人胃癌细胞BGC803，
[0043] 人结肠癌细胞SW480，
[0044] 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640中培养基，
[0045] 溶剂:二甲亚砜(简称为DMS0)。
[0046] CCK-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案
[0047] 本试验按照SRB方法，以斑蟊素为阳性对照，DMS0溶剂为空白对照，进行了浓度为 50nnmol/mL的去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3对肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803和结肠癌 细胞SW480的三种肿瘤细胞的抑制活性测试。
[0048]具体测试方案为：选用待测肿瘤活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增 殖抑制试验采用EnoGeneCell?Counting Kit-8(简称为CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞 消化、计数、制成浓度为1 X 105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入1 OOyL细胞悬液(每孔1 X104个细胞）；96孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；每孔加入100yL相应的含药 物的培养基，作用浓度为50yMol/L(g卩：微摩尔/升），同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳 性对照组（阳性对照分别选用斑蝥素和喜树碱），每组5复孔;96孔板置于37°C，5%⑶2培养 箱中培养72小时后;每孔加入10yL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪 测定在450nm处的吸光值（简称0D值），计算各个化合物对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞 BGC803和结肠癌细胞SW480的抑制率。实验结果详见表1。
[0049]肿瘤细胞生长抑制率
[0050]表1、去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3对于三种肿瘤细胞的抑制活性 [0051]
[0052]~由表1可知，在50nmol/L的相当低的作用浓度下，本发明合成得到的去甲斑蝥素单胃 酸单酯衍生物3对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803和结肠癌细胞SW480三种肿瘤细胞 具有较好的抑制效果，可将其用于制备上述三种抗肿瘤的候选药物。
【主权项】
1. 一种新型的去甲斑莖素单酸单醋衍生物，其结构式如式3所示，其中，R选自C1-C3的烷基或苄基。2. 权利要求1所述的去甲斑莖素单酸单醋衍生物3的合成方法，包括步骤：1)、5-締去甲 斑莖素在有机溶剂中在催化剂存在下加氨还原得到去甲斑莖素2,2)、去甲斑莖素2与相应 的醇(ROH)反应得到去甲斑莖素单酸单醋衍生物3;合成路线为：上述合成路线中，醇ROH中R基团的选取同上述式3所示化合物结构中相应R基团的选取 相同。3. 根据权利要求2所述的合成方法，其中，所述步骤1)的催化剂选自Pd/C，Pd(0H)2/C， Pt/C或Raney Ni等氨化催化剂;所述步骤1)的催化剂优选Pd/C或Pd(0H)2/C。4. 根据权利要求2所述的合成方法，其中，所述步骤2)的醇ROH选自选自C1-C3的烷基或 苄基;更优选为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或节醇。5. 根据权利要求2所述的合成方法，其中，所述步骤1)的采用的反应溶剂为酸类溶剂、 面代控或醇类溶剂，例如：乙酸、丙酸、四氨巧喃、二氯甲烧、氯仿、甲醇或乙醇。6. 根据权利要求2所述的合成方法，其中，所述步骤2)中采用的反应溶剂可W为相应的 醇溶剂或者是面代控溶剂，例如:二氯甲烧或氯仿。7. 权利要求1所述的去甲斑莖素单酸单醋衍生物3用于制备肝癌、胃癌及结肠癌Ξ种抗 肿瘤药物的用途。
【文档编号】A61P1/00GK106083879SQ201610451738
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】王先恒, 赵长阔, 贾佳, 罗灿敏, 李晓飞
【申请人】遵义医学院