专利名称：一种红曲菌液态发酵生产橙色素的方法
技术领域：
一种红曲菌液态发酵生产橙色素的方法，属于生物工程和色素制备技术领域。
背景技术：
红曲色素目前已确定结构的六种成分为橙色素(红斑红曲素、红曲玉红素)、黄色素(红曲素、黄红曲素)、紫色素(红斑红曲胺和红曲玉红胺)。其研究已经较为成熟，其在食品上的应用多是利用红曲色素中的红色素作为着色剂，是一种混合色素。
在红曲色素的混合色素中，橙色素是一种最为鲜艳夺目的色素。如果用于食品或其它需要着色的产品，可以为其增加一种可供选择的鲜艳色调。而且宫慧梅及L.Martinkova等都提到橙色素具有一定的抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌以及大肠杆菌，其原理被认为可能是红曲色素与蛋白质类物质结合在一起，以至于使蛋白质变性，抑制细菌生长起到防腐等作用。因此它是红曲中一种主要的抑菌物质，其抑菌性与吸光度呈正相变化。另外，Carels和Shepherp认为红色素、黄色素都是由橙色素经化学氧化而得来的，即橙色素是红曲色素合成中的一个重要中间体。
橙色素是红曲色素生物合成途径中的一个中间成分，性质比较活泼，易被氧化或还原而成黄色素或红色素。作为一种橙色调的红曲色素，目前在国内外仅限于小样生产，均未实现大规模生产，在食品及其它领域的应用上也未得到充分的开发研究，但因其颜色较为独特、醒目，在着色剂行业应用前景广阔，是值得开发的红曲色素品种。
发明内容
本发明目的是为了寻找一种高效生产红曲橙色素且可以大批量生产的方法。主要工艺路线利用红曲菌，通过深层通风发酵改变培养基配方及发酵条件生产出以橙色调(红斑红曲素或红曲玉红素)为主的红曲色素。
本发明技术方案采用红曲橙色素的液态深层发酵及喷雾干燥方法。
(1)菌种以红曲霉菌(Monascus spp.)9903为出发菌种，该菌种已在“食品与生物技术”第21卷第1期P43-47，2002年1月公开，由江南大学生物工程学院提供。
(2)培养基斜面培养基土豆培养基。
基础发酵培养基KH2PO4，1～5g/L；K2HPO4，1～5g/L；MgSO4·7H2O，0.2～0.8g/L；CaCl2，0.05～0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；ZnSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；MnSO4·H2O，0.015～0.06g/L，NaNO3，1～4g/L，pH3.0～6.0。
(3)摇瓶发酵条件培养基基础发酵培养基中加入玉米淀粉40～80g/L作为碳源，硫酸铵2～6g/L作为氮源，初始pH3.0～6.0，装液量100mL/500mL三角瓶，培养基经过糊化后进行接种，接种量孢子悬浮液4mL，30℃往复式摇床，行程10cm，振荡培养，发酵时间3.5～5.5天。
(4)15L发酵罐发酵通风量20～40L/min，培养温度28～32℃，转速200～400r/min，接种量5％，培养90～120小时，培养基同摇瓶发酵所用培养基，并在使用前进行糊化，发酵罐的有效装液量为10L，底液量为7L，在发酵过程中再流加糊化的培养基，发酵18小时开始流加操作，流加速度为0.03L/h。
最佳的发酵条件为摇瓶发酵和15L发酵罐发酵所用培养基为基础发酵培养基中加入玉米淀粉40g/L作为碳源，硫酸铵2g/L作为氮源，初始pH6.0；摇瓶发酵时间为4.0天，15L发酵罐发酵时间为108小时。
(5)喷雾干燥发酵液进行高压均质，压力为3kgf/cm2，或胶体磨将菌体破碎后，加入助干燥剂糊精，加入糊精的量为糊精发酵液以Kg/L计为0.02～0.06，进风温度170～200℃，出口温度70～100℃，喷头压力1～4kgf/cm2，流速1.5～3.0L/h，喷雾干燥得到粉末状橙色素产品(I)。
或(6)将步骤(4)所得发酵液进行精制发酵液经超声波破碎或高压均质后将细胞破碎，释放出胞内的色素，5000r/min、20min高速离心得菌丝体，用甲醇或乙醇进行萃取，萃取3次至溶液无明显橙色，过滤后合并滤液，加入助干燥剂糊精，加入糊精的量为糊精发酵液以Kg/L计为0.02～0.06，进行喷雾干燥，喷雾干燥条件同步骤(5)，得色调高一些的粉末状橙色素产品(II)。
或萃取后的合并滤液继续进行板层析分离，选用G-60型硅胶作为板层析介质真空浓缩至橙色素色价为3000～4500U/mL，浓缩液用于第一次板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，刮下显橙色的谱带Rf＝0.7941，再用甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液旋转浓缩至橙色素色价3000～4500U/mL，浓缩液用于第二次板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下显橙色谱带Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液浓缩得橙色素针状结晶(III)。
或萃取后的合并滤液继续进行柱层析分离，选用青岛产硅胶作为柱层析介质柱子型号为28mm×500mm，最大上样量为色价在3000～4500U/mL的橙色素浓缩液4～8mL，流动相为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之间，收集显橙色的流出液，流出液旋转浓缩至橙色素色价3000～4500U/mL，浓缩液用于板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下显橙色谱带Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液浓缩得橙色素针状结晶(III)。
橙色素精制工艺中用溶剂浸提，食品行业用的橙色素产品均用乙醇进行浸提，化工及其它行业使用的橙色素产品用甲醇进行浸提。
本发明的有益效果本发明采用一株高产色素的红曲菌9903，为生产以橙色素为主的红曲色素，并提高橙色素含量进行了发酵条件优化及液态发酵工艺条件的优化，以期为以后橙色素的大规模工业化生产及在食品色素开发应用上做基础工作。另外，对橙色素的喷雾干燥工艺及其精制也进行了研究，得到了较纯的橙色素，希望为其开拓更为广泛的用途，如应用于饮料、化妆品(如口红)等产品中。
红曲高产橙色素的摇瓶实验，确定出高产橙色素的菌种及以无机氮源为唯一氮源的培养基配方；红曲橙色素的液态深层发酵，确定出工业化生产红曲橙色素的操作工艺参数；一步法喷雾干燥的红曲橙色素产品的制备参数指标液态发酵生产红曲橙色素的色价(15L罐)三罐平均稳定达到100U/mL以上，发酵液经喷雾干燥后所得产品色价为1000U/g，色调OD465nm/OD510nm大于1。
在15L的发酵罐中发酵液色价达到121.7U/mL，色调值达到1.13；经不同精制途径得到不同色价及色调的橙色素产品，直接喷雾干燥得到的橙色素产品(I)色价达到1030.75U/g，色调值达到1.99；经过萃取而后喷雾干燥的橙色素产品(II)色价高达2000U/g以上，色调高达2.45；产品(III)得到了纯的橙色素针状结晶。
图1橙色素产品(III)全波长扫描图。
图2橙色素产品(III)的液相色谱图。
图3橙色素产品(III)的质谱图。
具体实施例方式
实施例1.培养基优化碳源对产橙色素的影响选择葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糯米粉、麦芽糖和糊精为碳源进行实验。碳源浓度50g/L，培养基的其他配比见基础发酵培养基。在以玉米淀粉作为9903菌种发酵的碳源时，橙色素色价及菌体量均远远高于采用其他碳源时，说明玉米淀粉很可能不仅仅对菌体的生长作贡献，更重要的是对橙色素这个次级代谢产物的合成起到积极的作用，玉米淀粉的这种影响可能是玉米淀粉的成分较复杂，而所含的无机或有机成分也较多，对红曲霉而言营养成分更加齐全，因而更有利于橙色素的次级代谢产物的生成。由此确定，玉米淀粉为最佳产橙色素碳源。糯米粉中则因可能含有有机氮源，致使一部分所生成的橙色素与氨基酸结合生成红色素。
培养基中不同浓度的玉米淀粉对红曲霉9903产橙色素的影响，分别选取了20，40，60，80g/L五个浓度水平，另外尝试玉米淀粉与葡萄糖的不同配比。通过考虑橙色素色价的高低及色调，最终选用浓度为40～80g/L的玉米淀粉作为培养基的碳源。
氮源对产橙色素的影响实验结果表明，不同氮源对橙色素产量的影响因氮源种类不同而不同，色泽也有很大差异。在实验的8种氮源中，四种有机氮源(蛋白胨、味精、玉米浆、酵母膏)产橙色素色价几乎都低于使用四种无机氮源(硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠)时产橙色素，且颜色均显红色，色调(OD465nm/OD510nm)均小于1。而使用无机氮源时，硝酸铵和硝酸钠的色价相对于硫酸铵和氯化铵又较低，且其色调小于1。使用硫酸铵时不仅色价远远高于其它氮源，而且色调也相对较高，达到1.68，因此选其作为产橙色素氮源。同时又进一步确定了产橙色素最高时的硫酸铵浓度为2～6g/L。
使用有机氮源时，橙色素色价低，主要原因是有机氮源中含较多的其它氨基酸，这会与所生成的橙色素进一步合成为红色素，使橙色素减少。
硫酸铵作氮源，色价值高的原因主要是铵离子被利用后，硫酸根离子存在于发酵液中，可使发酵液保持在酸性。这种酸性可使红曲菌处于更佳的生理状态。
培养基初始pH对产橙色素的影响红曲菌的发酵过程中，发酵液大多数时间是处于酸性范围内，因此在弱酸性的培养基初始条件下，比较易于菌体的生长，产橙色素色价也相对较高，随着pH值升高，橙色素色价逐渐下降。色调则随pH值升高而一直呈下降趋势。根据实验结果确定培养基的初始pH为3.0～6.0。
不同取样时间对产橙色素的影响在以上试验的基础上测定红曲菌9903产橙色素的生长曲线，我们可以看出在3天前橙色素产量随时间增长而快速增长，在3～5.5天左右处于平稳生产期，在5.5天之后就有急剧下降，由此可以看出橙色素应属于红曲菌9903的一个次级代谢中间产物，因此我们将取样时间取在3～5.5天之间的中间，取3.5～4.5天。
培养基成分的四因素三水平正交实验选择碳源、氮源、起始pH、发酵时间为考察因素，其余成分同基础发酵培养基。考察指标为465nm所测色价即橙色素色价。因素及水平的安排见表1，实验方案和结果见表2。
表1 因素水平表
表2 正交实验结果
比较四种因素的极差R，C的极差最大，其次是B、D，A的极差最小，说明培养基起始pH对红曲菌9903产橙色素能力影响最大，其次是添加氮源浓度及发酵时间，而添加碳源浓度在实验中的变化范围内的影响不明显。根据实验的结果，选择最佳因素水平为A1B1C3D2，即玉米淀粉40g/L，硫酸铵2g/L，起始pH值为6.0，发酵时间为4.0天，以此作为本发明的最佳培养基配方。
实施例2.发酵条件的优化发酵参数的优化采用实施例1正交实验所得的最佳培养基配方，进行了15L发酵罐深层培养操作条件的优化。红曲液态发酵是好氧发酵，因此溶氧水平是个重要的参数，它直接影响发酵产物尤其是次级代谢产物橙色素的产量。通过改变通风量与搅拌转速形成高、低两种不同水平的溶氧条件，考察红曲霉在这两种不同的溶氧条件下产橙色素的情况，结果发现低溶氧情况下，产橙色素的最高峰时间明显滞后于高溶氧情况下，橙色素的最终产量也明显低。可见溶氧对红曲发酵产橙色素的影响是较大的。在实验的基础上最终确定出红曲霉9903液态发酵产橙色素的最佳操作工艺条件为通风量20～40L/min，培养温度28～32℃，转速200～400r/min，接种量5％，培养90～120小时。
液态分批发酵红曲霉在15L液态发酵罐中的生长过程大致可以分为3个阶段生长停滞期(0～18h)，在这个阶段菌体量、橙色素色价、桔霉素含量都基本没有增长；第二个阶段(18～108h)，菌体量迅速增加，同时橙色素产量也伴随着菌体生长迅速提高，而桔霉素则开始增长极缓慢(18～90h)，而后又迅速增长(90～108h)；最后一个阶段(108～120h)，菌体的干重几乎没怎么增加，而橙色素产量却有一定程度的降低，色调也随之有些降低。
可见，在前期橙色素的产生与菌体生长基本同步，而桔霉素含量则没什么太大变化，说明橙色素的生产与菌体的生长有一定的偶联。但在后期，橙色素含量降低时桔霉素含量却迅速增长，原因可能是前期桔霉素合成的有关酶基因开始启动，或经过一定时间的桔霉素前体物合成并积累后，桔霉素分子的构成单元才开始组装成桔霉素分子，而橙色素生长则是与菌体生长相偶联的，到菌体快速生长期时，橙色素也大量合成。另外后期橙色素的减少以及色调值的降低，原因可能是橙色素与培养基中的氨基酸进行了反应，生成了水溶性的红色素。
液态流加发酵，流加糊化的玉米淀粉对橙色素产量的影响流加技术可以消除底物和产物抑制作用。因此我们尝试了流加糊化的培养基的方法，以期可以提高橙色素产量。在以上实验的基础上，采用有效装液量为10L的发酵罐，底液量为7L，发酵18h时开始进行流加操作，流加速度为0.03L/h，在此操作条件下，最终橙色素产量比间歇发酵提高了18％，可见，利用流加发酵液可以克服初始营养浓度过高而引起的对菌体生长及橙色素生长的抑制，从而有效地提高橙色素生成量和原料利用率。最终发酵液的橙色素色价三罐平均稳定达到121.7U/mL，色调值达到1.13。
实施例3.橙色素的提取和精制橙色素的直接喷雾干燥法生产经过实验研究确定出橙色素发酵液直接进行喷雾干燥时的操作工艺参数条件发酵液进行高压均质，压力为3kgf/cm2，或胶体磨将菌体破碎后，加入助干燥剂糊精，加入糊精的量为糊精∶发酵液以Kg/L计为0.02～0.06，进风温度170～200℃，出口温度70～100℃，喷头压力1～4kgf/cm2，流速80～120mL/h。在此操作条件下最终得到橙色素产品(I)，其色价为1030.75U/g，色调为1.99，色素得率达到66.67％。
橙色素的浓缩结晶和喷雾干燥。
不同萃取剂提取红曲橙色素的效果比较分别量取一定体积的橙色素发酵液，进行超声波破碎或其它菌体破碎方法，如均质机、胶体磨等后，5000r/min、20min高速离心得菌丝体，分别用15mL正己烷、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲苯、丙酮、甲醇、乙醇或甲酸进行萃取。2h后进行冷冻离心，移取上清液进行适当稀释后用于紫外分光光度计在300～600nm内扫描，测其在410nm、465nm和510nm处的色价，结果发现使用乙酸时对橙色素的提取效率最好，色价高达3240.625U/g，但是在往色素样品中加入萃取剂时发现有放热现象，说明乙酸有可能与色素发生了反应，因此很难保证测得的色价就是自然的橙色素的含量。在使用正己烷或环己烷进行萃取时，萃取相中以黄色素和橙色素为主，红色素几乎没有，因此如果从考虑将色素分离的角度来看，环己烷或正己烷是比较理想的选择，但二者对橙色素的提取率相对较低。使用乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷时，橙色素的提取率相对较高，但同时黄色素的提取率也很高，尤其是乙酸乙酯。而使用甲醇和乙醇时，不仅橙色素的提取率很高，而且黄色素的提取率极低，这样对分离很有利，因此我们选用甲醇或乙醇作为提取橙色素的最佳萃取剂，这要看最终的橙色素产品的使用领域了，如果是用在食品行业，则选择无毒的乙醇作为萃取剂，若是应用于化工及其它行业则选用甲醇作为萃取剂，因为相对于乙醇，甲醇对橙色素的萃取率及最终萃取的色价都很高。最终用有机溶剂萃取之后的橙色素产品(II)进行喷雾干燥后，橙色素色价达2000U/g以上，色调值达2.45。
第一次板层析所用硅胶及展开剂的选择实验发现使用硅胶进行板层析的效果较好，而对不同规格的硅胶进行比较，国产青岛的硅胶效果极好，因此我们选定了山东青岛海洋化工集团的G-60型硅胶作为本专利研究的板层析介质。对于展开剂的选择首先考虑的是将红曲萃取液中的大部分色素与橙色素分离开来，在实验的基础上，我们选择了以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1为展开剂，对红曲色素进行一个初步分离，最终得到Rf＝0.7941的橙色谱带。
第二次板层析所用展开剂的选择由第一次板层析的结果可以看出红曲色素是种混合色素，只在普通光照下就可以看到18种，而在紫外线下又可以看到很多普通光照下看不到的荧光物质。橙色素与红色素可以完全分离，但与黄色素相邻很近，有部分重叠，需进一步分离。因此我们进行了第二次板层析，对于所使用的不同展开剂来说，采用环己烷∶氯仿∶异丙醇(6∶4∶3)时色素不能分开，反而对色素具有一定的分散作用。使用甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(8∶2∶1)是分离效果最好，总共分离出8条色带，最终得Rf＝0.7458的橙色素谱带，按精制流程最终得到了纯的橙色素产品(III)，用于下一步的质谱鉴定用。
柱层析分离橙色素方法的确定柱层析硅胶选用青岛产的工业级的柱层析硅胶，柱子型号为28mm×500mm，最大上样量为色价在3000～4500U/mL的橙色素浓缩液4～8mL，流动相为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之间，收集显橙色的流出液，流出液旋转浓缩至橙色素色价3000～4500U/mL，浓缩液用于板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下显橙色谱带Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液浓缩得橙色素针状结晶(III)。此法与板层析方法相比，处理量大，且方法简单，易于工业化生产。
橙色素产品(III)的质谱鉴定将橙色素晶体用甲醇溶解，适当稀释后用于紫外分光光度计在300～600nm内扫描，扫描如图1所示，得橙色素的最大吸收波长为465nm。
我们用质谱检验的方法对所制得的橙色素进行了定性检测。图2为橙色素液相色谱图，由图知目标物质可能为16.86min时出的峰，其正离子模式质谱图如图3所示，由图3可清晰看出M+Na(分子量为377.6)和M+H(分子量为355.6)的准分子离子峰，确定其分子量为354D，与文献上报道的红斑红曲素的分子量相同，其峰为单一组分。另外由图2还可以看出，制备的橙色素产品中主要成分确实为红斑红曲素，从峰面积归一化计，红斑红曲素占了样品总量的85.93％。因此可以认为是比较纯的，可以用于其性质等研究。
权利要求
1.一种红曲菌液态发酵生产以橙色素为主的红曲色素，并提高橙色素含量及色调OD465nm/OD510nm的方法，其特征是采用红曲橙色素的液态深层发酵及喷雾干燥方法，(1)菌种以红曲霉菌(Monascus spp.)9903为出发菌种，(2)培养基斜面培养基土豆培养基，基础发酵培养基KH2PO4，1～5g/L；K2HPO4，1～5g/L；MgSO4·7H2O，0.2～0.8g/L；CaCl2，0.05～0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；ZnSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；MnSO4·H2O，0.015～0.06g/L，NaNO3，1～4g/L，pH3.0～6.0，(3)摇瓶发酵条件培养基基础发酵培养基中加入玉米淀粉40～80g/L作为碳源，硫酸铵2～6g/L作为氮源，初始pH3.0～6.0，装液量100mL/500mL三角瓶，培养基经过糊化后进行接种，接种量孢子悬浮液4mL，30℃往复式摇床，行程10cm，振荡培养，发酵时间3.5～5.5天，(4)15L发酵罐发酵通风量20～40L/min，培养温度28～32℃，转速200～400r/min，接种量5％，培养90～120小时，培养基同摇瓶发酵所用培养基，并在使用前进行糊化，发酵罐的有效装液量为10L，底液量为7L，在发酵过程中再流加糊化的培养基，发酵18小时开始流加操作，流加速度为0.03L/h，(5)喷雾干燥发酵液进行高压均质，压力为3kgf/cm2，或胶体磨将菌体破碎后，加入助干燥剂糊精，加入糊精的量为糊精发酵液以Kg/L计为0.02～0.06，进风温度170～200℃，出口温度70～100℃，喷头压力1～4kgf/cm2，流速1.5～3L/h，喷雾干燥得到粉末状橙色素产品(I)，或(6)将步骤(4)所得发酵液进行精制发酵液经超声波破碎或高压均质后将细胞破碎，释放出胞内的色素，5000r/min，20min高速离心得菌丝体，用甲醇或乙醇进行萃取，萃取3次至溶液无明显橙色，过滤后合并滤液，加入助干燥剂糊精，加入糊精的量为糊精发酵液以Kg/L计为0.02～0.06，进行喷雾干燥，喷雾干燥条件同步骤(5)，得色调高一些的粉末状橙色素产品(II)，或萃取后的合并滤液继续进行板层析分离，选用G-60型硅胶作为板层析介质真空浓缩至橙色素色价为3000～4500U/mL，浓缩液用于第一次板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，刮下显橙色的谱带Rf＝0.7941，再用甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液旋转浓缩至橙色素色价3000～4500U/mL，浓缩液用于第二次板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下显橙色谱带Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液浓缩得橙色素针状结晶(III)，或萃取后的合并滤液继续进行柱层析分离，选用青岛产硅胶作为柱层析介质柱子型号为28mm×500mm，最大上样量为色价在3000～4500U/mL的橙色素浓缩液4～8mL，流动相为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之间，收集显橙色的流出液，流出液旋转浓缩至橙色素色价3000～4500U/mL，浓缩液用于板层析，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下显橙色谱带Rf＝-0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速离心，上清液浓缩得橙色素针状结晶(III)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是摇瓶发酵和15L发酵罐发酵所用培养基为基础发酵培养基中加入玉米淀粉40g/L作为碳源，硫酸铵2g/L作为氮源，初始pH6.0；摇瓶发酵时间为4.0天，15L发酵罐发酵时间为108小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述橙色素精制工艺中用溶剂浸提，食品行业用的橙色素产品用乙醇进行浸提，化工及其它行业使用的橙色素产品用甲醇进行浸提。
全文摘要
红曲菌液态发酵生产橙色素的方法，属于生物工程和色素制备技术领域。本发明以一株高产色素红曲霉菌9903为出发菌株，生产以橙色素为主的红曲色素，并提高橙色素含量及色调(OD
文档编号C09B61/00GK1814783SQ20051009576
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月16日 优先权日2005年11月16日
发明者许赣荣, 张慧娟 申请人:江南大学