专利名称：一株具有腐殖质还原活性的玫瑰色库克菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌及其应用，特别涉及一株玫瑰色库克菌及其在厌氧条件下进行腐殖质还原的应用 。
背景技术：
腐殖质是土壤有机质的重要组成部分，广泛存在于土壤、沉积物和水生环境中。研究证实，腐殖质可以通过吸附、络合及氧化还原反应参与物质的生物地球化学循环，影响污染物的转化与归宿。其中，腐殖质还原反应能够促进环境中有机质的矿化和生物脱氮作用， 介导铁、锰元素的形态转化，促进有机污染物的降解，影响重金属的迁移转化，具有重要的环境学意义及应用前景。腐殖质的微生物还原作用是指厌氧条件下，微生物在胞内氧化有机物释放电子， 电子经胞内呼吸链传递到胞外腐殖质(电子受体)使其还原，并产生能量维持微生物自身生长的过程，这是微生物一类重要的胞外代谢形式，具有腐殖质还原能力的微生物成为腐殖质还原菌。到目前为止，已经有150多株腐殖质还原菌被分离得到，包括地杆菌 {Geobac ter sp.)、希瓦氏菌属{Shewanella sp.)、脱亚硫酸菌属 iPesulfi tobac teri um sp.)、产甲烧菌属iMethanobacterium sp.)等,但至今未发现具有腐殖质还原活性的库克菌 QCocuria sp.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐盐碱的腐殖质还原菌。本发明的另一个目的在于提供上述菌种在厌氧条件下还原腐殖质的应用。申请人:经过大量试验研究，从海南省儋州市木薯渣堆肥样品中分离纯化得到一株玫瑰色库克菌，具有较强的腐殖质还原能力，从而实现了本发明的目的。本发明提供的玫瑰色库克菌iKocuria rosea HN01),于2012年2月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院，中科院微生物研究所)，保藏号为=CGMCC No. 5810，保藏中心建议的分类命名为心curia rosea。 保藏中心于2012年2月23日鉴定菌株是存活的。实验数据表明，本发明菌株在厌氧条件下能耦联电子供体(如葡萄糖、鹿糖、甲醇、乙醇或丙三醇)的氧化，还原腐殖质模式物蒽醌_2，6-二苯磺酸(AQDS)。与多株已报道的腐殖质还原菌相比，该菌株具有耐盐碱特性，电子利用谱广特点。本发明的菌株，具有良好的应用前景。
图I是本发明菌株的1000倍光学显微图。
具体实施方式
玫瑰色库克菌的富集、分离及纯化
1)取5g堆肥样品于IOOmL液体分离培养基中，每升液体分离培养基中含I.Og葡萄糖 (电子供体)、0. 412g AQDS (蒽醌-2，6-二苯磺酸，电子受体，腐殖质模式物)、2. 5g NaHC03、
·0.25g NH4CUO. 678g NaH2PO4 2H20、0. Ig KCl ,10. OmL 维生素溶液、10. OmL 微量元素溶液， pH值为10，其中，维生素溶液是每升去离子水中含5. Omg叶酸、0. 2mg维生素B6、6. 5mg维生素B2、3. Omg维生素BlUOmg烟酰胺、Img泛酸钙、0. 2mg维生素B12、2. Omg维生素H ;微量元素溶液是每升去离子水中含I. 6g乙二胺四乙酸、3. Og MgSO4 7H20、0. 5g MnSO4 H2O,
·1.Og NaCU0. Ig CoCl2 6H20、0. Ig CaCl2,0. Olg CuSO4 5H20、0. Olg AlK(SO4)2 12H20、 0. Olg H3B03、0. 025g Na2MoO4 2H20 ；
2)往已接种样品的培养液中鼓充高纯混合气体(N2/C02=80/20)>30分钟，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，37 °C静置培养，观察培养液的颜色变化情况；
3)当培养液颜色由无色变为橙红色直至不再变化时，以10%的接种量转接富集培养三
次；
4)最后，将第四代反应后的培养液进行适当稀释后均匀涂布于固体分离培养基上(固体分离培养基为每升液体分离培养基中加入18g琼脂粉)，30°C培养48h，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化；
5)将纯化得到的单菌落重新接到新鲜的厌氧液体培养基中，静置厌氧培养，验证菌株对AQDS的还原特性。本发明菌株的形态特征
(I)菌体形态特性
采用常规的光学显微镜下观察，该菌株为革兰氏阳性菌，球状，四联或八联形式排列。(2)菌落形态特征
在pH为8. 5的牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基平板上30°C好氧培养48小时后观察，菌落呈玫瑰粉色，表面光滑，不透明，边缘整齐，菌落直径为2 3mm。本发明菌株的生理生化特征
该菌具兼性厌氧生长能力，在厌氧条件下，能以葡萄糖、蔗糖、甲醇、乙醇或丙三醇为电子供体，还原AQDS。其他已经测定的生理生化特征见表I。
权利要求
1.一株玫瑰色库克菌，其保藏号为CGMCC No. 5810。
2.权利要求I所述玫瑰色库克菌在腐殖质还原中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株具有腐殖质还原活性的玫瑰色库克菌及其应用。该菌株的保藏号为CGMCC No.5810。与多株已报道的腐殖质还原菌相比，该菌株具有耐盐碱特性，电子利用谱广，具有很好的腐殖质还原特性。
文档编号C09K17/00GK102618463SQ201210077990
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者李勤奋, 武春媛, 陈楠 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所