本发明涉及土壤酸化修复技术和重金属污染治理
技术领域：
，具体而言，涉及一种生物土壤修复剂的制备方法及荧光假单胞菌H4的应用。
背景技术：
：土壤酸化退化是指长期大量施用化肥、化学农药和其他化学农资产品造成的土壤退化现象，包括土壤板结、土壤酸值增大和作物病害加剧。近十年来，这种土壤现象已由点发展到面、由北向南、由平原向高海拔土壤快速发展，造成农业作物欠收或绝收。土壤酸化退化的本质是土壤微生物体系发生了彻底改变。这种土壤微生物体系的改变，造成了作物病害微生物增多且易于存活在土壤中，产生大量的有机酸，叠加了土壤pH降低。农业部制定了“土壤调理剂”产品标准，旨在改变土壤物理性质；也曾经有人利用氯化苦进行化学修复，均见效甚微。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供荧光假单胞菌H4在修复耕地土壤中的应用，荧光假单胞菌H4于2017年2月20日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，分类命名为PseudomonasfluorescensH4，保藏号为CCTCCNO:M2017052。荧光假单胞菌H4能破坏作物致病微生物平衡、分解出作物生长所需的矿物质和生物质，改变土壤中的微生物体系，起到修复土壤使作物增产的作用，并且不对土壤造成二次污染。本发明的目的之二在于提供上述荧光假单胞菌H4在制备生物土壤修复剂中的应用。将荧光假单胞菌H4应用于生物土壤修复剂的制备中，使制备得到的生物土壤修复剂保持荧光假单胞菌H4修复土壤的作用，同时加入有协同作用的土壤团粒成分，可制备治理土壤板结的生物土壤修复剂。本发明的目的之三在于提供一种生物土壤修复剂的制备方法。该方法制备的生物土壤修复剂菌体活性高，易于在水稻、烟叶、茶叶、魔芋、蔬菜、中药材、小麦和水果种植土壤中培养，存活时间长，对上述田块中的致病微生物进行扑食或拮抗，具有效果明显，适用区域广，使用方便和适用作物品种诸多特点。本发明的目的之四在于提供一种生物土壤修复剂，其由上述生物土壤修复剂的制备方法制备而成。该生物土壤修复剂中土壤团粒材料与菌体混合在一起，形成稳定的微循环体系，更好地发挥修复土壤使作物增产的作用。本发明采用以下技术方案来实现。荧光假单胞菌H4在修复耕地土壤中的应用，该荧光假单胞菌H4于2017年2月20日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，分类命名为PseudomonasfluorescensH4，保藏号为CCTCCNO:M2017052。上述荧光假单胞菌H4在制备生物土壤修复剂中的应用。一种生物土壤修复剂的制备方法，其包括：将上述荧光假单胞菌H4进行发酵，得到发酵液。用发酵液与土壤团粒材料以及腐熟牦牛粪混合，得到生物土壤修复剂。本发明实施例的一种生物土壤修复剂的制备方法及荧光假单胞菌H4的应用的有益效果是：(1)本发明提供的荧光假单胞菌H4通过破坏作物致病微生物平衡、供应有机物质改善土壤的理化性质、改善土壤生态系统的循环从而达到修复土壤使作物增产的目的，不对土壤造成二次污染，是一种修复土壤的主要微生物。(2)本发明提供的生物土壤修复剂的制备方法，通过该方法得到含有土壤团粒材料和提供微生物养分天然培养基的生物土壤修复剂。(3)本发明提供的生物土壤修复剂包括土壤团粒材料，这种材料与荧光假单胞菌H4能够混合，形成稳定的体系，促进作物增产和提高作物品质。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行操作。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种生物土壤修复剂的制备方法及荧光假单胞菌H4的应用进行具体说明。荧光假单胞菌H4在修复耕地土壤中的应用，该荧光假单胞菌H4于2017年2月20日在位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO:M2017052，分类命名为PseudomonasfluorescensH4。优选地，上述耕地土壤为水稻种植土壤、烟叶种植土壤、茶叶种植土壤、魔芋种植土壤，蔬菜种植土壤、中药材、小麦种植土壤或水果种植土壤中的任意一种。荧光假单胞菌H4为革兰阴性菌，细胞呈杆状。荧光假单胞菌H4通过破坏作物致病微生物平衡、供应有机物质改善土壤的理化性质、土壤生态系统的循环，从而达到修复土壤的作用，不对土壤造成二次污染。并且其具有分解出水稻、烟叶、茶叶、魔芋、蔬菜、中药材、小麦和水果等作物生长所需矿物质和生物质的功能，能够提高上述作物产量和改善品质。上述荧光假单胞菌H4在制备生物土壤修复剂中的应用。将荧光假单胞菌H4应用于生物土壤修复剂的制备中，使制备得到的生物土壤修复剂既保持荧光假单胞菌H4修复土壤的作用，同时加入有协同作用的土壤团粒材料和培养微生物的天然培养基材料，得到效果明显的生物土壤修复剂。一种生物土壤修复剂的制备方法，其包括：将上述荧光假单胞菌H4进行发酵，得到发酵液。用发酵液与土壤团粒材料及腐熟牦牛粪混合，得到生物土壤修复剂。优选地，上述发酵液的OD600值为1.0-2.0，并且发酵液采用四级培养得到。四级培养分别为活化培养、一级发酵、二级发酵和三级发酵。通过该方式培养得到活菌体，既大量扩繁了菌体，又使得菌体保持旺盛的生长活力。优选地，上述土壤团粒材料为聚丙烯酰胺，并且聚丙烯酰胺的聚合度为1100-1300。优选地，聚丙烯酰胺为无菌状态，并且混合过程在无菌环境下进行。聚丙烯酰胺采用授权公告号为CN204208070U的实用新型专利提供的一种有机肥原料消毒机处理，以保持无菌状态。优选地，聚丙烯酰胺与发酵液的质量之比为0.1-0.5:1。聚丙烯酰胺(PAM)由丙烯酰胺/丙烯酸盐交联共聚而成。聚丙烯酰胺可分为阴离子、阳离子和非离子等类型。阳离子网状聚丙烯酰胺是一种高吸水性树脂，可用做农田保水剂。阴离子线型聚丙烯酰胺因其分子链长等特征，用作土壤改良剂，在控制土壤侵蚀、防止水土流失方面起到了重要的作用。聚丙烯酰胺可有效的改善土壤结构、将板结土壤形成团粒结构，增加土壤的透气性和持水量、降低土壤容重、提高渗透率、提高土壤抗蚀能力，进而提高作物产量。概括说来，聚丙烯酰胺具有保土、保水、保肥和增产的四大效应。优选地，对酸性土壤施用含阳离子型聚丙烯酰胺的生物土壤修复剂，对碱性土壤施用含阴离子型聚丙烯酰胺的生物土壤修复剂。优选地，腐熟牦牛粪与发酵液的质量之比为10-20:1。优选地，生物土壤修复剂中水的质量百分数为35％-40％。优选地，上述腐熟牦牛粪为无菌腐熟牦牛粪，并且整个混合过程在无菌环境下进行。腐熟牦牛粪为荧光假单胞菌的长期存活提供条件。无菌腐熟牦牛粪以及在无菌环境下进行混合均是为了保证荧光假单胞菌H4的活力。优选地，上述无菌腐熟牦牛粪同过以下方法制备而成：将牦牛粪干饼破碎成2mm以下粉体，然后喷洒水分至牦牛粪粉体中水分的质量百分数为50-80％，常温条件下自然发酵10-15天即得到腐熟牦牛粪。腐熟牦牛粪采用授权公告号为CN204208070U的实用新型专利提供的一种有机肥原料消毒机处理，得到的无菌腐熟牦牛粪备用。牦牛粪腐熟过程中，牦牛粪成分转化成作物生长需要小分子糖、多肽或氨基酸以及能够被作物吸收的生物碳类物质。腐熟牦牛粪呈黑褐色，手抓成团，落地成沙，带有清新泥土味，营养成分丰富。荧光假单胞菌H4附着在腐熟牦牛粪上，腐熟牦牛粪以培养基形式存在。生物土壤修复剂中菌体两年内保持含有20亿个菌/克左右。荧光假单胞菌H4与腐熟牦牛粪共同作用，将腐熟牦牛粪中的有效活性成分分解出，为作物生长提供所需的矿物质、生物质和有益菌，提高了作物的产量，并且无污染。一种生物土壤修复剂，其由上述的生物土壤修复剂的制备方法制备而成。本发明提供的生物土壤修复剂包括荧光假单胞菌H4和聚丙烯酰胺，所以其兼具二者修复土壤的功能。不仅如此，荧光假单胞菌H4和聚丙烯酰胺之间形成稳定的微循环体系，防止了菌体的流失，保持菌体集中生长，达到更优异的协同配合效果，更好地发挥修复土壤使作物增产和提高品质的作用。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例中提供一种生物土壤修复剂及其制备方法。其包括：1.1按以下各成分的质量百分数配置培养基：葡萄糖0.7％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.3％，氯化钠0.2％，蒸馏水98.2％。培养基中的各试剂采用生化级标准。配制完成后，在121℃灭菌30分钟后备用。1.2荧光假单胞菌H4的发酵液采用以下方法制备：1.2.1活化培养在50mL三角瓶中，装入上述培养基进行灭菌，按照菌种与培养基的体积比为1:48的比例接入菌种，并在26℃，170r/min的摇床中培养至菌液OD600值为0.2-0.4，得到活化培养液。1.2.2一级发酵在10L发酵罐中，将上述培养基放入一级种子罐后灭菌，调节pH至7.0，按照活化培养液与培养基的体积之比为1:18的比例接入活化培养液，28℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD600值为0.6-0.8，得到一级培养液。1.2.3二级发酵在50L发酵罐中，将上述培养基放入二级种子罐后灭菌，调节pH至7.0，按照一级培养液与培养基的体积之比为1:18的比例接入一级培养液，26℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD600值为1.0-1.4，得到二级培养液。1.2.4三级发酵在1000L发酵罐中，将上述培养基放入发酵罐后灭菌，调节pH至7.0，按照二级培养液与培养基的体积之比为1:18的比例接入二级培养液，26℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD值为1.6-2.0，得到发酵液。根据实际操作情况，在三级发酵过程中添加消泡剂和片碱，使最终得到的发酵液的pH为6.8。1.3按按重量份数计，取各原料混合均匀，得到生物土壤修复剂：发酵液1份，聚丙烯酰胺0.5份，腐熟牦牛粪20份。将牦牛粪干饼破碎至1-2mm粉体，然后喷洒水分至牦牛粪粉体上水分的质量百分数为50％，常温条件下自然发酵10天即得到腐熟牦牛粪。将腐熟牦牛粪和土壤团粒材料采用授权公告号为CN204208070U的实用新型专利提供的一种有机肥原料消毒机杀毒灭菌，备用。在无菌条件下，将杀毒灭菌后的聚丙烯酰胺、发酵液和灭菌后的腐熟牦牛粪在容器中混合均匀，并装袋封口。生物土壤修复剂中水的质量百分数为35％。实施例22.1按以下各成分的质量百分数配置培养基：葡萄糖0.8％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，氯化钠0.3％，KH2PO40.1％，蒸馏水97.7％。培养基中的各试剂采用生化级标准。配制完成后，在121℃灭菌30分钟后备用。2.2荧光假单胞菌H4的发酵液采用以下方法制备：2.2.1活化培养在50mL三角瓶中，装入上述培养基进行灭菌，按照菌种与培养基的体积比为1:50的比例接入菌种，并在28℃，180r/min的摇床中培养至菌液OD600值为0.2-0.4，得到活化培养液。2.2.2一级发酵在10L发酵罐中，将上述培养基放入一级种子罐后灭菌，调节pH至7.2，按照活化培养液与培养基的体积之比为1:20的比例接入活化培养液，28℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD600值为0.6-0.8，得到一级培养液。2.2.3二级发酵在50L发酵罐中，将上述培养基放入二级种子罐后灭菌，调节pH至7.2，按照一级培养液与培养基的体积之比为1:20的比例接入一级培养液，28℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD600值为1.0-1.4，得到二级培养液。2.2.4三级发酵在1000L发酵罐中，将上述培养基放入发酵罐后灭菌，调节pH至7.2，按照二级培养液与培养基的体积之比为1:10的比例接入二级培养液，28℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD600值为1.6-2.0，得到发酵液。根据实际操作情况，在三级发酵过程中添加消泡剂和片碱，使最终得到的发酵液的pH为6.7。2.3按按重量份数计，取各原料混合均匀，得到生物土壤修复剂：发酵液2份，聚丙烯酰胺0.6份，腐熟牦牛粪20份。将牦牛粪干饼破碎至1-2mm粉体，然后喷洒水分至牦牛粪粉体上水分的质量百分数为65％，常温条件下自然发酵13天即得到腐熟牦牛粪。将腐熟牦牛粪和土壤团粒材料采用授权公告号为CN204208070U的实用新型专利提供的一种有机肥原料消毒机杀毒灭菌，备用。在无菌条件下，将杀毒灭菌后的聚丙烯酰胺、发酵液和灭菌后的腐熟牦牛粪在容器中混合均匀，并装袋封口。生物土壤修复剂中水的质量百分数为40％。实施例33.1按以下各成分的质量百分数配置培养基：葡萄糖1.0％，蛋白胨0.8％，酵母膏0.5％，氯化钠0.4％，KH2PO40.2％，蒸馏水97.1％。培养基中的各试剂采用生化级标准。配制完成后，在121℃灭菌30分钟后备用。3.2荧光假单胞菌H4的发酵液采用以下方法制备：3.2.1活化培养在50mL三角瓶中，装入上述培养基进行灭菌，按照菌种与培养基的体积比为1:52的比例接入菌种，并在30℃，200r/min的摇床中培养至菌液OD值为0.2-0.4，得到活化培养液。3.2.2一级发酵在10L发酵罐中，将上述培养基放入一级种子罐后灭菌，调节pH至7.3，按照活化培养液与培养基的体积之比为1:22的比例接入活化培养液，30℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD值为0.6-0.8，得到一级培养液。3.2.3二级发酵在50L发酵罐中，将上述培养基放入二级种子罐后灭菌，调节pH至7.3，按照一级培养液与培养基的体积之比为1:22的比例接入一级培养液，30℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD值为1.0-1.4，得到二级培养液。3.2.4三级发酵在1000L发酵罐中，将上述培养基放入发酵罐后灭菌，调节pH至7.3，按照二级培养液与培养基的体积之比为1:12的比例接入二级培养液，30℃下，调节搅拌速度以及通气量，保持溶氧量大于25％，培养至菌液OD值为1.6-2.0，得到发酵液。根据实际操作情况，在三级发酵过程中添加消泡剂和片碱，使最终得到的发酵液的pH为6.6。3.3按按重量份数计，取各原料混合均匀，得到生物土壤修复剂：发酵液1份，聚丙烯酰胺0.1份，腐熟牦牛粪15份。将牦牛粪干饼破碎至1-2mm粉体，然后喷洒水分至牦牛粪粉体上水分的质量百分数为80％，常温条件下自然发酵15天即得到腐熟牦牛粪。将腐熟牦牛粪和土壤团粒材料采用授权公告号为CN204208070U的实用新型专利提供的一种有机肥原料消毒机杀毒灭菌，备用。在无菌条件下，将杀毒灭菌后的聚丙烯酰胺、发酵液和灭菌后的腐熟牦牛粪在容器中混合均匀，并装袋封口。生物土壤修复剂中水的质量百分数为38％。实施例4本实施例提供对实施例2中制备的生物土壤修复剂的应用。具体地，通过施用生物土壤修复剂，考察生物土壤修复剂对烟叶种植土壤的改善作用以及对烟叶的增产作用，客观评价生物土壤修复剂在烟叶栽培中的实用价值，为生物土壤修复剂在修复土壤使作物增产中的推广应用提供依据。试验分别在湖北省恩施市城郊烟田(以下简称第一试验田)以及湖北省宣恩县罗川村烟田(以下简称第二试验田)进行。2014年第一试验田以及第二试验田均因青枯病导致烟叶绝收。2015年-2016年，对第一试验田以及第二试验田施用实施例2提供的生物土壤修复剂。施用方法为：按照烟草施肥标准化操作，在移栽时将生物土壤修复剂溶解在烟苗定根水，通过定根水灌根将生物土壤修复剂带入烟田土壤，施用量为2kg/亩，每年施用一次。2014年-2016年三年中，第一试验田以及第二试验田的土壤检测数据如表1所示：表1生物土壤修复剂对烟叶种植土壤的改善作用由表1可知，对第一试验田以及第二试验田施用本发明提供的生物土壤修复剂后，酸化的土壤明显得到修复，其具体表现为土壤pH值明显正常化，土壤中菌落数明显升高。2014年-2016年三年中，第一试验田以及第二试验田的烟叶产量及恢复度数据如表2所示：表2生物土壤修复剂对烟叶的增产作用表2中，恢复度以全市(县)的烟叶的平均亩产量为标准计算。具体地，第一试验田的恢复度＝第一试验田的亩产量/当年恩施市的平均亩产量；第二试验田的恢复度＝第二试验田的亩产量/当年宣恩县的平均亩产量。由表2可知，对第一试验田以及第二试验田施用本发明提供的生物土壤修复剂后，由于土壤明显被改善，烟叶的产量逐渐恢复，并且均恢复至80％以上。实施例5本实施例提供对实施例2中制备的生物土壤修复剂的应用。具体地，通过施用生物土壤修复剂，考察生物土壤修复剂对魔芋种植土壤的改善作用以及对魔芋的增产作用，客观评价生物土壤修复剂在魔芋栽培中的实用价值，为生物土壤修复剂在修复土壤使作物增产中的推广应用提供依据。在湖北省咸丰县忠堡镇魔芋示范田块上开展生物土壤修复剂试验。魔芋易感染细菌类软腐病，一旦爆发将造成绝收，魔芋行业里称其为“癌症”。魔芋一般生长2-3年，由于软腐病是土传病害不能连作。本试验在同一田块上跟踪两年，2014年5月至2016年12月。在2亩试验田进行小区对照试验。试验设计如下：对照组：亩施50kg复合肥；试验组：亩施50kg复合肥+生物土壤修复剂(2kg/亩)。品种为当地花魔芋籽芋，试验用种为同一批次，种子处理方法相同，对照组和试验组所选定的试验田块肥力和排水水平相当，采用套种玉米遮阴。小区采用三次重复，每个小区留有保护行种植玉米。试验调查期为两年，包括软腐病发病率、魔芋产量和土壤pH值。软腐病发病率每年调查两次，分别在发病初期6月中旬和发病高期，产量和土壤测定第二年挖芋时测定。发病率的调查方式为：随机选取一行魔芋，调查病株数。发病率调查结果如表3所示：表3魔芋软腐病发病率调查表时间对照组试验组2014年6月5％1％2014年8月20.2％4.1％2015年6月8.1％1.2％2015年8月25.6％4.8％由表3可知，施用本发明提供的生物土壤修复剂后，软腐病的发病率明显降低。分别对对照组和试验组田块的魔芋产量和土壤pH进行考察，其中，产量的考察方式为：挖出两个小区魔芋进行称重，其结果如表4所示:表4魔芋产量和土壤pH测定参数对照组试验组魔芋产量(kg/亩)1388.451609.68土壤pH值6.26.6由表4可知，施用本发明提供的生物土壤修复剂后，魔芋的单产量明显提高，种植土壤的pH值明显正常化，充分说明本发明提供的生物土壤修复剂具有修复土壤使作物增产的作用。这种现象也在云南省富源县、四川省遂宁市射洪县和贵州省六盘水市魔芋种植户反映中得到证实。实施例6本实施例提供对实施例2中制备的生物土壤修复剂的应用。具体地，通过施用生物土壤修复剂，考察生物土壤修复剂对水稻种植土壤的改善作用以及对水稻的增产作用，客观评价生物土壤修复剂在水稻栽培中的实用价值，为生物土壤修复剂在修复土壤使作物增产中的推广应用提供依据。2014年发明人委托成都市农林科学研究院水稻所在四川省成都市大邑县王泗镇丰都村水稻种植户开展生物土壤修复剂试验。试验地前茬为小麦，亩产400kg，试验地土壤肥力中等，地势平坦，排灌条件良好，海拔500米。试验设两个处理：(1)空白试验，(2)生物土壤修复剂(2kg/亩)试验。试验品种、播种、栽插、施肥和水分管理等其他条件与当地常规管理方法一致。当年水稻试验结果如下：6.1生长势：生物土壤修复剂处理株高为130.7cm，比对照高11.8cm；6.2生育期：生物土壤修复剂与对照之间没有显著差异，均为153天；6.3产量及主要经济性状生物土壤修复剂处理的亩产为450.58kg，比对照增产113.1kg，增产25.1％。生物土壤修复剂的亩有效穗为16.39万，比对照多0.69万；穗长为29.5cm，比对照长0.9cm；穗粒数为131.2，比对照多35.1；结实率为73.9，比对照高17.5；千粒重30.2克，比对照高0.1克。6.4经四川省粮油中心监测站检验，生物土壤修复剂处理的样品好于对照，可以提升0.5个大米等级。同样，发明人2015年和2016年相继委托湖北省恩施州农科院水稻所、湖南省湘西州农业局粮经站和在江苏省南通市海安县南莫镇水稻种植基地进行了试验，试验结果与成都市大邑县的数据基本一致。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页1 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