背景技术：
近几年来，荧光成像作为生命科学领域的一项非侵入性技术，由于其物质的灵敏度比较高，操作简便，成本低廉等优异的特点，引起了科研领域的们的广泛关注。到目前为止，已经合成了各种荧光分子并且用作生物成像试剂。在这些众多的试剂中，长期示踪细胞过程的长期细胞示踪剂的开发对于生物研究者监测癌细胞的发生、发展、侵袭和转移等生物学过程具有十分重要的意义。
作为众所周知的荧光无机纳米粒子、量子点（qds），由于它们的独特的光的高亮度和光的稳定性而被用作各种生物技术应用的荧光细胞示踪剂。例如，cdse/zns量子点已经被作为细胞示踪剂用于活细胞的长期细胞成像，具有比较高发射和优良的光稳定性。但不幸的是，qd的重金属成分（例如cd2+）具有较高的细胞毒性，这些弱点限制了它们在生物成像中的很多应用。此外，绿色的荧光蛋白（gfp）及其它的其他家族，一个高荧光分子，已被广泛地用作长期体外细胞示踪剂。然而，由于gfp本身的一些缺点，如蛋白水解酶敏感、斯托克斯位移的变化、光的稳定性差、荧光蛋白的传染能干扰很多正常的细胞的功能等，阻碍了gfp探针的更多的实际应用。
聚集发光型聚合物量子点（aie）相对于无机半导体的量子点（qds）和有机染料一些小分子，优点显而易见。如半峰宽相对窄、发射峰比较对称、细胞毒性较小、生物相容性好。使其在光学、生物学等领域有很好的应用前景。目前已经通过不同的合成方法制备聚集发光型小分子和聚合物，aie型聚合物作为细胞探针而被逐渐的合成出来。tpe（四苯乙烯）是一种经典的aie（aggregationinducedemission聚集诱导发光）分子，即在溶液中没有荧光，但是固体却存在较强的荧光，与传统聚集淬灭分子刚好相反，因此在有机光电材料等领域具有重要的应用，也越来越多的引起人们的关注。例如，唐本忠等人通过将大量四苯乙烯（tpe）接到壳聚糖（cs）链上，然后再让其聚合物作为长时间追踪活细胞的细胞显影剂，接着报道了一种新型的荧光探针。张等人从四苯乙烯基聚（n-异丙基丙烯酰胺）（tpe-pnipam）合成了一种atrp对温度敏感的有机聚合物纳米粒子，可作为长期细胞示踪的细胞示踪剂，在hela细胞中可以进行长达七代的细胞传代。然而，关于这种基于aie型聚合物的报道还是相对很少。因此，设计和合成基于aie的聚合物作为生物应用的长期示踪剂是非常具有挑战性的任务。
对环境条件变化相对较小或内部变化能够作出响应的刺激响应性聚合物具有很多的价值或更广的生物显影应用。热响应性聚合物在较低临界溶解温度（lcst）下显示可溶-不溶相变。然而ph敏感聚合物通过改变ph值的大小，进而改变聚合物的尺寸来响应周围介质变化。有文献报道了聚[n-[2-(二乙氨基)乙基]丙烯酰胺]（pdeaeam）的温度和ph/co2响应的均聚物（song,z.;wang,k.;gao,c.;wang,s.;zhang,w.anewthermo-,ph-,andco2-responsivehomopolymerofpoly[n-[2-(diethylamino)ethyl]acrylamide]:isthediethylaminogroupunderestimatedmacromolecules.2016,49,162-171.），其ph/co2是可调。但目前仅有一种刺激的荧光高分子材料还不能达到生物医学应用的要求。基于aie型的多刺激响应聚合物结合了聚集发光（aie）和刺激响应聚合物的优点，表现出良好的水溶解性，生物相容性和聚集发光特性，并且在外部刺激时表现出结构和发光相应的变化。与aie型荧光团结合的这些多刺激响应性聚合物可以用作克服长期细胞追踪存在的主要问题。因此，开发具有多响应性荧光聚合物是十分有必要的。其中，热敏性、ph和二氧化碳响应性聚合物在新型刺激性材料的设计和合成中是最受欢迎的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有多响应性的tpe-pdeaeam聚合物量子点的制备方法；
本发明的另一目的是对于上述具有多响应性的tpe-pdeaeam聚合物量子点的结构、aie特性以及作为细胞示踪剂用于活细胞的长期细胞成像的应用进行分析。
一、tpe-pdeaeam聚合物量子点的制备
（1）4-羟苯基乙烯的合成
以四氢呋喃（thf）为溶剂，锌粉、ticl4（zn为还原剂，ticl4为催化剂，混合还原性催化剂），在氩气保护下，4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮以1:1~1:1.2的摩尔比回流24h；应结束后冷却至室温，加入k2co3溶液猝灭反应，然后过滤，用乙酸乙酯萃取，柱层析分离提纯，得淡黄色固体4-羟基四乙烯（tpe）。
锌粉的加入量为4-羟基二苯甲酮、二苯甲酮总摩尔量的3~4倍；ticl4的加入量为4-羟基二苯甲酮、二苯甲酮总摩尔量的2~3倍。
（2）4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯（tpe-oh）的合成
将4-羟基四乙烯、12-溴-1-十二烷醇和k2co3溶解在无水乙腈中，在氩气保护下回流20~24h；反应结束后冷却至室温，过滤反应液并蒸发有机层，产物经柱层析分离提纯，得淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯。
12-溴-1-十二烷醇的作用是延长碳链，增强疏水性，4-羟基四乙烯与12-溴-1-十二烷醇的摩尔比为1:1~1:1.2。
k2co3的作用是提供碱性和吸水性。4-羟基四乙烯与k2co3的摩尔比为1:1~1:1.2。
（3）tpe-bpm的合成
将4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯（tpe-oh）、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴加入到无水四氢呋喃（thf）中，在室温下搅拌反应20~24小时；反应结束后，过滤反应液；浓缩滤液得粗产品，粗产品经柱层析分离提纯，得淡黄色固体产物即为tpe-bmp。
三乙胺的作用是提供碱性。tpe-oh与三乙胺的摩尔比为1:1~1:1.25。
2-溴-2-甲基丙酰溴的作用是合成引发剂，tpe-oh与2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1:1~1:1.25。
（4）tpe-pdeaeam的合成
将n(2-(二乙基氨基)乙基)丙烯酰胺（deaeam）溶解在水-甲醇混合溶剂中，在氩气保护下依次加入三(2-二甲氨基乙基)胺（me6tren）、cubr和tpe-bmp，在室温下搅拌20~24h，然后将反应原液用超纯水透析70~72小时，再将透析液冷冻干燥70~72小时，得到淡黄色固体粉末，即为tpe-pdeaeam。
所述水-甲醇混合溶剂，水和甲醇的体积比为1.5:1~2:1。
三(2-二甲氨基乙基)胺（me6tren）的作用是cu2+配体；其加入量为deaeam质量的19%~20%。
cubr的作用是催化剂。其加入量为deaeam质量的0.5%~1%。
pdeaeam与tpe-bmp的质量比为60:1~65:1。
二、tpe-pdeaeam聚合物量子点的结构和特性
1、核磁氢谱
图1、2分别为tpe-bpm、tpe-pdeaeam的核磁氢谱。化学位移在6.9ppm左右处出现了芳环质子氢的信号峰，1.0ppm处出现了甲基氢的信号峰，2.6ppm和3.2ppm处分别为tpe-pdeaeam上面的亚氨基的氢峰，1.5ppm出现了tpe-pdeaeam上的亚甲基信号峰。这表明tpe分子和pdeaeam成功的共价结合在一起。
2、红外谱图
图3为tpe-pdeaeam的红外谱图。在1658cm-1处我们可以清楚的观察到酰胺的特征峰，在1553cm-1处有n-h键的振动。进一步证明了聚合物量子点的结构与我们设计的一致。
3、gpc测试
表1为tpe-pdeaeam的gpc数据。
通过gpc测试进一步证明了tpe-pdeaeam的结构，数均分子量（mn）和重均分子量（mw）分别为1.1×104和2.1×104。
4、聚合物tpe-pdeaeam聚合物量子点在水溶液中自组装的形貌
图4为tpe-pdeaeam聚合物量子点在四氢呋喃溶液和水溶液中的丁达尔效应。当一束光线透过胶体，从入射光的垂直方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”，这种现象叫丁达尔现象，通过这个现象，我们初步判断tpe-pdeaeam聚合物量子点在水溶液中的自组装比较好。
图5为tpe-pdeaeam聚合物量子点溶解在水溶液里，浓度为2mg/ml的流体动力学尺寸，显示出量子点的流体力学大小是保持在250nm左右。聚合物量子点的粒径在250左右。
图6为tpe-pdeaeam聚合物量子点在水溶液中自组装的形貌（sem）。证明tpe-pdeaeam聚合物纳米粒子是形状相对规整的球形，并且纳米粒子的大小相对均一，粒径大约250nm。
5、tpe-pdeaeam聚合物量子点的aie特性
thf和h2o两种溶剂都能够很好的溶解tpe-pdeaeam聚合物链段。聚合物量子点tpe-pdeaeam在一定的温度范围在水中能全部溶解形成透明的溶液。其水溶液在紫外灯（365nm）下仍然是发光的，而其在纯thf溶液中是几乎肉眼看不见光的。这现象和tpe小分子的aie（聚集发光）性质非常的相似。
我们考察浓度变化对聚合物荧光的影响，结果发现，当其聚合物tpe-pdeaeam水溶液浓度由0.001mg·ml-1增大到1mg·ml-1时，则会表现出随着聚合物浓度的增大荧光也会随之增强，激发和发射波长分别为337nm和475nm。随着浓度的增大，tpe-pnipam分子必定会发生一定的聚集，而荧光显著增强展示了其aie特性。
观察了tpe-pdeaeam在不同比例的水/四氢呋喃混合溶剂中的荧光变化，进一步证明了该聚合物的aie特性：随着h2o体积分数的增加，tpe-pdeaeam的荧光强度以非线性的方式减弱。h2o的体积分数超过80%后，其荧光强度急剧增加，这与文献中的报道的聚集诱导荧光增强很相似。其主要的原因是随着h2o体积分数的增加，聚合物链发生了扩张，使得tpe发生聚集，tpe分子聚集的使得发射荧光增加。
6、温度对tpe-pdeaeam聚合物量子点荧光强度的影响
tpe-pdeaeam聚合物量子点的温度敏感性能可以很容易地通过在高于lcst（相转变温度）的温度下加热tpe-pdeaeam聚合物量子点的水溶液，然后在冷却至温度低于lcst来确定。tpe-pdeaeam聚合物量子点的水溶液在室温下是透明的。在加热至高于lcst之后溶液变得浑浊不透明，当冷却至室温时，其变得浑浊并进一步变得透明，这证实了在lcst下tpe-pdeaeam的可逆的相变。图7显示当浓度为2g/l的tpe-pdeaeam聚合物量子点水溶液的随温度变化的透光率。当聚合物浓度为2g/l时，tpe-pdeaeam在lcst水溶液中的lcst为60℃。
此外，研究温度对tpe-pdeaeam聚合物量子点荧光性质的影响。图8作为tpe-pdeaeam聚合物量子点溶液从25℃到66℃中的荧光的变化：tpe-pdeaeam聚合物量子点随温度的升高荧光强度反而降低。这是由于pdeaeam的聚合物链段是温敏性材料。
7、tpe-pdeaeam聚合物量子点的ph敏感特性
考察ph值改变对tpe-pdeaeam聚合物量子点荧光强度的影响。众所周知，加入盐酸或氢氧化钠容易破坏分子间氢键，导致tpe-pdeaeam聚合物量子点原有的聚集状态发生变化。由于聚集态的变化，将发生带有aiegen的聚合物的荧光强度的变化。图9为tpe-pdeaeam聚合物量子点在不同ph溶液中荧光光谱（左）及不同ph下在水溶液中的相对荧光强度（i/i0）的变化（右）（tpe-pdeaeam]=2.0gl-1），表明随着ph值的增大聚合物量子点的荧光增强。因此，ph敏感的荧光tpe-pdeaeam可能被用作有希望的光学传感器，用于低或高ph值测定。
8、tpe-pdeaeam聚合物量子点的co2敏感特性
二氧化碳响应性聚合物和二氧化碳捕捉材料近年来受到了极大的关注，因为二氧化碳具有良好的生物相容性，优异的膜通透性，丰富的可用性，无毒性和良好的可逆性等诸多优点。二氧化碳可以很容易地与反应性基团如胺或脒反应，生成亲水性化合物和脒基聚合物，构成了二氧化碳响应性聚合物中最大的一类。因此，tpe-pdeaeam聚合物量子点的轴承脒基团，可以与二氧化碳和水反应形成带电荷的脒鎓碳酸氢盐，将具有二氧化碳响应性。图10为tpe-pdeaeam聚合物量子点在不同的co2体积溶液的荧光光谱，插图为相对荧光强度的线性（i/i0）与co2体积的关系。如图10所示，当co2体积从0.0增加到0.4ml时，tpe-pdeaeam聚合物量子点的荧光强度急剧下降，伴随着小的蓝移。插图表明，空白荧光强度与猝灭荧光强度之比（i0/i）与0.0~0.4ml的co2加入量成线性关系，说明tpe-pdeaeam聚合物量子点可作为co2的荧光传感器。原因归因于tpe-tetrapdeaeam中二氧化碳和叔胺基团之间的相互作用，其证实了叔胺基团可被二氧化碳质子化形成带电荷的碳酸氢铵。
二、tpe-pdeaeam对hela细胞的毒性评估
对于生物医学应用，评估材料的细胞毒性是至关重要的。
（1）细胞铺板：取对数生长期的hela细胞，0.25%的胰酶（含edta）进行消化，血细胞计数板进行计数，使细胞得密度为1×104/孔。（边缘孔要用无菌pbs填充好）。用移液枪将每孔100µl细胞液接种于96孔培养板中，培养箱温度为37℃，co2为5%的饱和湿度培养箱内培养。每组需要设置3个复孔。
（2）细胞给药：co2培养箱（温度为37℃、5%的co2含量）中培养24h，然后分别加入浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml的tpe-pdeaeam。
（3）加入mtt：加药的hela细胞在培养箱中培养24小时后，倒掉原来有的培养基，再在每孔加100ml的mtt溶液，再放入培养箱中培养4h后停止再培养。实验的操作过程需尽量避光。
（4）溶解hela细胞：将96孔培养板重的培养基吸出，每孔加入150ml的dmso孵育40min，使沉淀完全溶解，方可进行检测（操作过程勿摸96孔培养板的底部以免影响检测的实验结果）。
（5）酶标仪测定96孔培养板的各孔的od值：将震荡好的hela细胞用酶标仪进行测定，首先我们需要打开电脑，让电脑和酶标仪进行连接，然后再打开测定的软件，对96孔板进行测量，测量的结果用excel进行了数据处理。
（6）hela细胞的存活率：测出od值，按下面的公式计算含有tpe-pdeaeam的hela细胞存活率（%）。然后以tpe-paa溶液的浓度为横坐标，以含有tpe-pdeaeam的hela细胞存活率为纵坐标。
细胞存活率(%)=(od试验组-od调零组)/（od空白组-od调零组）×100％
用不同浓度的tpe-pnipam处理48小时后hela细胞毒性测试，结果见图11。显示，95%以上的hela细胞存活，用不同浓度的tpe-pnipam孵化（50~400μgml-1）48h。说明tpe-pdeaeam的毒性较小，有望用于细胞显影或更多的生物应用。
三、tpe-pdeaeam对hela细胞成像应用
基于aie荧光的特点，tpe-pdeaeam聚合物量子点可以被用作细胞成像的荧光剂。选择hela细胞作为机体来证明tpe-pdeaeam聚合物量子点用于体外细胞追踪应用的能力。将hela细胞以10000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中。培养箱培养24小时后，将细胞用不同浓度的tpe-pdeaeam处理。用配好的pbs洗涤hela细胞，然后将mtt溶液（5mg/ml，10μl）和hela细胞培养基（90μl）加入到每个孔中的细胞中去。将96孔培养板在37℃的（含co25%）培养箱中温育4小时。除去含有mtt的培养基，加入二甲亚砜（dmso，100μl）溶解由活细胞形成的甲瓒晶体。使用rt-6100酶标仪在492nm处测量吸光度。
首先，将hela细胞预先接种12孔培养板细胞片上。培养基是含有1％链霉素和10％胎牛血清的1640溶液。然后将12孔板置于5％浓度的co2和37℃温度的潮湿培养箱中24小时。用100μgml-1tpe-paa处理hela细胞，24小时后，取出细胞片，用磷酸盐缓冲溶液将平板冲洗三次。在共焦荧光显微镜下拍摄细胞成像图片。使用olympusfv1000共聚焦显微镜（olympustokyojapan）在332nm激发并且在460~490nm发射。
为了评估tpe-pdeaeam聚合物量子点是否可以作为探针长期追踪细胞，用tpe-pdeaeam聚合物量子点处理的细胞每48小时重复传代，通过共聚焦显微镜测定每一代tpe-pdeaeam聚合物量子点的细胞内荧光。hela细胞与100μgml-1的tpe-pdeaeam聚合物量子点孵育24小时（第一代）后，观察到hela细胞中tpe-pdeaeam聚合物量子点的信号强度（图12）。细胞内荧光强度相对较弱的区域可能是细胞核的位置，说明聚合物量子点成功地逃脱了完整聚集的内体区室并选择性地染色了hela细胞的细胞质区域。从hela细胞内的tpe-pdeaeam聚合物量子点监测到强的信号，即使与100μgml-1浓度孵育48小时后，还是能观测到强的荧光信号。染色后的细胞在长达20天的时间内（即长达9代）仍能保持较强的荧光强度。这表明荧光聚合物可以作为荧光生物探针用于长期细胞追踪。
综上所述，通过atrp聚合合成了四苯乙烯接枝聚[n-[2-(二乙基氨基)-乙基]丙烯酰胺]（tpe-pdeaeam聚合物量子点）的多刺激响应聚合物。由于tpe-pdeaeam聚合物量子点中含有二乙氨基和丙烯酰胺基团，tpe-pdeaeam聚合物量子点对温度、ph和co2的刺激都作出相应的响应。当聚合物量子点的浓度为2.0gl-1时，tpe-pdeaeam聚合物量子点在水溶液中的lcst为60℃，表明其热转变温度有可能通过改变溶液浓度而改变。同时，tpe-pdeaeam聚合物量子点的荧光发射强度随着温度的升高而荧光从25℃下降到66℃，表明其聚合物量子点的荧光一定的热响应性。由于ph调节剂引起的盐析效应，进而引起tpe-pdeaeam聚合物量子点的荧光强度的变化。此外，由于tpe-pdeaeam聚合物量子点中的叔胺基团可被co2质子化而形成带电的碳酸氢铵，聚合物的荧光强度随着加入co2体积的增加而显着降低，且i/i0的比例与加入量二氧化碳的体积从0.4到1.2毫升，聚合物量子点的荧光强度变化不是很明显。更有趣的是，荧光聚合物显示出独特的聚集诱导发射（aie）行为，可以用作用于细胞成像的长期示踪荧光剂。
附图说明
图1为tpe-bpm的核磁氢谱。
图2为tpe-pdeaeam的核磁氢谱。
图3为tpe-pdeaeam的红外谱图。
图4为tpe-pdeaeam聚合物量子点在四氢呋喃溶液和水溶液中的丁达尔效应。
图5为tpe-pdeaeam聚合物量子点溶解在水里浓度为2mg/ml的流体动力学尺寸。
图6为tpe-pdeaeam聚合物量子点在水溶液中自组装的形貌（sem）。
图7为浓度为2g/l的tpe-pdeaeam聚合物量子点水溶液的随温度变化的透光率。
图8作为tpe-pdeaeam聚合物量子点溶液从25℃到66℃中的荧光的变化
图9为tpe-pdeaeam聚合物量子点在不同ph溶液中荧光光谱（左）及不同ph下在水溶液中的相对荧光强度（i/i0）的变化（右）（tpe-pdeaeam]=2.0gl-1）。
图10为tpe-pdeaeam聚合物量子点在不同的co2体积溶液的荧光光谱。插图：相对荧光强度的线性（i/i0）与co2体积的关系。
图11为tpe-pdeaeam聚合物量子点的细胞毒性测试。
图12为tpe-pdeaeam聚合物量子点染色hela细胞不同代数的共聚焦显微镜图像。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明tpe-pdeaeam聚合物量子点的合成以及应用做进一步说明。
1、tpe-pdeaeam聚合物量子点的合成
（1）单体n(2-(二乙基氨基)乙基)丙烯酰胺（deaeam）的合成：根据文献程序合成n[2-（二乙基氨基）乙基]丙烯酰胺（deaeam）：在磁力搅拌下，将n,n-二乙基乙二胺（75mmol，8.72g）和chcl3（75ml）加入250ml的单口圆底烧瓶中，然后将烧瓶置于冰水浴。随后，在1小时内缓慢滴加入溶于chcl3（50ml）中的丙烯酰氯（90mmol，7.2ml）。在完全加入丙烯酰氯之后，再在室温下反应1h。反应液用naoh水溶液（100ml，1mol/l）和水（100ml）洗涤，最后用无水mgso4干燥，旋转蒸发除去chcl3的溶剂，粗产物通过乙酸乙酯作为洗脱剂，得到deaeam（10.3g，产率85％）。
（2）羟苯基乙烯的合成：将zn粉（20g，0.31mol），4-羟基二苯甲酮（9.5g，0.05mol）和二苯甲酮（8.7g，0.05mol）溶解在200mlthf中，在氩气保护条件下加入ticl4（30.0ml，0.27mol）并回流24h。反应结束后，将反应混合液冷却至室温，加入150ml10%的k2co3溶液并剧烈搅拌，然后将混合液过滤，并用乙酸乙酯萃取得有机层，最后采用柱层析分对产物进行分离提纯（淋洗剂：v乙酸乙酯:v石油醚=1:10），最终得到6.1g淡黄色固体4-羟基四乙烯，产率约为61%。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.13–6.97(m,15h),6.89(d,j=8.6hz,2h),6.55(d,j=8.6hz,2h),4.60(s,1h)。
13cnmr(151mhz,cdcl3)δ153.96(s),144.28–143.62(m),140.29(d,j=33.3hz),136.37(s),132.71(s),131.52–131.16(m),127.63(d,j=15.1hz),126.24(s),114.57(s).
esi-ms：m=348.48。
（3）4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯（tpe-oh）的合成：将4-羟基四乙烯（3.48g，0.01mol）、12-溴-1-十二烷醇（0.28ml，0.012mol）和k2co3（1.66g，0.012mol）溶解在100ml无水乙腈中，在氩气保护条件下回流24h。反应结束后，待反应液冷却至室温后，将反应液过滤，将有机层蒸发，最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯（淋洗剂：v乙酸乙酯:v石油醚=1:5），最终得到2.6g淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯，产率约为61%。
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.16-7.05(m,15h),6.98(d,j=8.8hz,2h),6.67(d,j=8.8hz,2h),3.92-3.85(m,2h),3.65(t,j=6.7hz,2h),3.45-3.37(m,1h),2.03-1.82(m,2h),1.81-1.75(m,2h),1.67–1.54(m,4h),1.47(dd,j=14.2,9.0hz,4h),1.35(s,8h)。
13cnmr(151mhz,cdcl3)δ153.96(s),144.28-143.62(m),140.29(d,j=33.3hz),136.37(s),132.71(s),131.52-131.16(m),127.63(d,j=15.1hz),126.24(s),114.57(s)。
（4）tpe-bpm的合成：取tpe-oh（5.26g，0.01mol）、三乙胺（1.75ml，0.0125mol）和2-溴-2-甲基丙酰溴（1.5ml，0.0125mol），加入盛有无水thf（150ml）的三口烧瓶中（250ml）。该混合物在室温下搅拌24小时，反应结束后，反应液过滤；滤液浓缩，粗产品采用柱层析分离法对产物进行分离提纯（淋洗剂：v乙酸乙酯:v石油醚=1:10），最终得到7g淡黄色固体产物tpe-bmp，产率约为65%。
1hnmr(600mhz,h2o)δ8.89–7.06(m,15h),7.06–6.92(m,2h),6.85–6.49(m,2h),4.39–4.16(m,2h),3.93–3.70(m,2h),2.14–1.91(m,7h),1.93–0.80(m,24h).
tpe-bpm的表征数据如图1。
（5）tpe-pdeaeam的合成：将deaeam（3g）溶解在10ml水和5ml甲醇(v水:v甲醇=2:1)混合溶剂中并搅拌20min，然后在氩气保护条件下依次加入三（2-二甲氨基乙基）胺me6tren(0.6g)、cubr(0.0282g，0.1960mmol)、tpe-bmp(0.05g,0.05mmol)，在室温下搅拌24h后，将反应原液用超纯水透析72小时，透析液冷冻干燥72小时，得到2.3g淡黄色固体粉末，即为tpe-pdeaeam。tpe-pdeaeam的表征数据如图2和图3。
1hnmr(600mhz,h2o):δ7.01-6.25(m),3.20(m),2.51(m),1.90-1.30(m),0.93(m)。
2、tpe-pdeaeam对hela细胞成像应用
首先，将hela细胞预先接种12孔培养板细胞片上。培养基是含有1％链霉素和10％胎牛血清的1640溶液。然后将12孔板置于5％浓度的co2和37℃温度的潮湿培养箱中24小时。用100μgml-1tpe-paa处理hela细胞，24小时后，取出细胞片，用磷酸盐缓冲溶液将平板冲洗三次。在共焦荧光显微镜下拍摄细胞成像图片。使用olympusfv1000共聚焦显微镜（olympustokyojapan）在332nm激发并且在460~490nm发射。
图12为tpe-pdeaeam聚合物量子点染色hela细胞不同代数的共聚焦显微镜图像，比例尺是25微米。图12显示，hela细胞与100μgml-1的tpe-pdeaeam聚合物量子点孵育24小时（第一代）后，观察到hela细胞中tpe-pdeaeam聚合物量子点的信号强度。细胞内荧光强度相对较弱的区域可能是细胞核的位置，说明聚合物量子点成功地逃脱了完整聚集的内体区室并选择性地染色了hela细胞的细胞质区域。此外，从hela细胞内的tpe-pdeaeam聚合物量子点监测到强的信号，即使与100μgml-1浓度孵育48小时（第代）后，我们还是能观测到强的荧光信号。用tpe-pdeaeam聚合物量子点处理的细胞每48小时重复传代，通过共聚焦显微镜测定每一代tpe-pdeaeam聚合物量子点的细胞内荧光。结果表明，染色后的细胞在长达20天的时间内（即长达9代）仍能保持较强的荧光强度。因而tpe-pdeaeam聚合物量子点可能是一个理想的长期荧光细胞示踪剂。