本发明涉及复合材料技术领域，具体涉及一种同时实现近红外光动力学治疗和荧光成像的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料及制法。
背景技术
光动力学治疗目前已经广泛应用在医疗领域，如治疗老年斑，过滤性病毒引起的感染，恶性肿瘤等。光动力学治疗的原理是在特定波长的光的激发下，光敏剂分子吸收光，从基态激发到激发态，处于激发态的分子不稳定，能与周围的氧气分子反应，将能量传递给氧气分子，生成单线态氧，而自身重新回到基态。因此，光动力学治疗是一种对组织侵入最小，有高的时空特定性的治疗方式。目前，光卟啉类分子已经在临床上应用。
但是限制光动力学治疗的主要因素是光敏剂和激发光波长。常用的光敏剂分子水溶性差，光稳定性差，对近红外光的吸收差。同时，常用的激发光波长大多在紫外区和可见光区。截止到目前为止，可以使用近红外光进行光动力学治疗同时实现近红外成像的复合材料还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种同时实现近红外光动力学治疗和荧光成像的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料及制法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
一种同时实现近红外光动力学治疗和荧光成像的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料，所述上转换纳米粒子的化学表达式为：β-nayf4:yb3+,er3+，并且在所述上转换纳米粒子的外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层；
所述石墨烯量子点的外表面包裹一层聚丙烯酸；
所述上转换纳米粒子通过表面的氨基与所述石墨烯量子点表面的羧基形成酰胺键连接在一起。
在上述技术方案中，所述复合材料的形状为球形，粒径尺寸为35nm。
一种同时实现近红外光动力学治疗和荧光成像的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料的制法，包括以下步骤：
步骤1、制备上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+
在氩气保护下，将ycl3·6h2o、ybcl3·6h2o和ercl3·6h2o与油酸和油胺混合均匀，使用控温电热套加热至形成均一的溶液；待溶液冷却到室温后，加入naoh和nh4f的甲醇溶液并搅拌；随后，升温、抽真空，以除去溶液中的甲醇、氧气和水分；再向溶液中通氩气，并将温度升高到300℃，保持1小时，待溶液冷却到室温后，将得到的纳米晶用无水乙醇沉淀下来，并用环己烷和乙醇交替清洗，得到上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+；
步骤2、上转换纳米粒子外表面包裹一层二氧化硅并修饰氨基
将步骤1得到的上转换纳米粒子分散在环己烷中，再加入曲拉通x-100，正己醇和水，搅拌至形成均相溶液；随后，加入氨水、正硅酸乙酯和丙氨基三乙氧基硅烷，室温下搅拌；再向该反应体系中加入丙酮将产物沉淀析出，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子；
步骤3、制备石墨烯量子点
将甲酰胺溶液放置在高压反应釜中，并在160℃下加热1个小时，待反应体系降温到室温后，反应产物用水稀释并用透析袋透析，最后，得到暗绿色溶液，将该暗绿色溶液用滤膜过滤以除去大的残留物，再真空蒸干，得到石墨烯量子点；
步骤4、用聚丙烯酸包裹石墨烯量子点
将聚丙烯酸溶解在水中，超声得到均匀的溶液，再将该溶液与步骤3得到的石墨烯量子点的水溶液混合，并室温搅拌，离心，清洗，烘干，得到外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点；
步骤5、制备上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料
将步骤4得到的外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点分散在水中，加入edc和nhs，搅拌均匀，再加入步骤2得到的外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子，继续搅拌，最后，将溶液离心，并用二次水清洗，烘干，得到上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料。
在上述技术方案中，步骤1具体为：
在氩气保护下，将0.8mmolycl3·6h2o、0.18mmolybcl3·6h2o、0.02mmolercl3·6h2o、6ml油酸和15ml油胺加入50ml三颈烧瓶中搅拌混合均匀；使用控温电热套加热到160℃至形成均一的溶液，并保持一小时；待溶液冷却到室温后，加入10ml含2.5mmolnaoh和4mmolnh4f的甲醇溶液并搅拌30分钟；随后，升温到100℃抽真空，以除去溶液中的甲醇、氧气和水分；再向溶液中通氩气，并将温度升高到300℃，保持1个小时；待溶液冷却到室温后，将得到的纳米晶用无水乙醇沉淀下来，并用环己烷和乙醇交替清洗三次，得到上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+。
在上述技术方案中，步骤2具体为：
称取25mg步骤1得到的上转换纳米粒子分散在3.35ml环己烷中，再加入4.15ml环己烷，1.8ml曲拉通x-100，1.8ml正己醇和450μl水，搅拌30分钟以形成均相溶液；随后，加入100μl氨水，150μl正硅酸乙酯和50μl丙氨基三乙氧基硅烷，室温下搅拌24小时；在该反应体系中加入丙酮将产物沉淀析出，并用无水乙醇洗涤两次，60℃真空干燥，得到外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子。
在上述技术方案中，步骤3具体为：
将含有质量比为3％的50ml甲酰胺溶液放置在高压反应釜中，并在160℃下加热1个小时；待反应体系降温到室温后，反应产物用250ml水稀释并用截留分子量3500da的透析袋透析一个星期；将得到的暗绿色溶液用0.22μm的滤膜过滤以除去大的残留物，将得到的最终的溶液真空蒸干得到石墨烯量子点。
在上述技术方案中，步骤4具体为：
将3g聚丙烯酸溶解在15ml水中，超声得到均匀的溶液；再将该溶液与步骤3得到的石墨烯量子点的水溶液混合，并室温搅拌24小时，离心，清洗，烘干得到外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点。
在上述技术方案中，步骤5具体为：
取0.05g步骤4得到外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点分散在10ml水中，加入1ml6mg/ml的edc和1ml2mg/ml的nhs，搅拌均匀，再加入0.1g步骤2得到的外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子，继续搅拌至少6小时，最后，将溶液离心，并用二次水清洗3次，30℃烘干，得到上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料。
本发明的有益效果是：
本发明提供的制法制备的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料，石墨烯量子点能很好的与上转换纳米粒子结合在一起，形状为均一的球形，粒径尺寸大约为35nm。该复合材料在980nm近红外光照射下可以产生单线态氧，对细胞进行杀伤；并且该复合材料能够进入细胞内，实现近红外下的红色荧光成像。
本发明提供的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料，其中石墨烯量子点的吸收光谱能够与上转换纳米粒子的发射光谱很好的重合在一起，所以两种材料会发生能量传递。当两者接触在一起时，在980纳米激光的照射下，上转换纳米粒子能够吸收近红外光，并发射出紫外光和可见光，发射出的紫外和可见光可以被石墨烯量子点吸收，与周围的氧气反应产生具有细胞毒性的单线态氧，同时发射出红光，从而实现近红外激发下的光动力学治疗和荧光成像。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料用于近红外激发下的光动力学治疗和近红外荧光成像的示意图。
图2为纳米材料的透射电镜图，其中图a、b、c分别代表石墨烯量子点、上转换纳米粒子和上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料的透射电镜图。
图3为本发明的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料的荧光光谱图。
图4为不同浓度的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料和mcf-7细胞的存活率的曲线图。
图5为本发明的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料在细胞内的成像照片，图中从左至右依次为在白光条件下、近红外照射下、及二者叠加后的照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做以详细说明。
结合图1说明本发明提供一种同时实现近红外光动力学治疗和荧光成像的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料，所述上转换纳米粒子的化学表达式为：β-nayf4:yb3+,er3+，并且在所述上转换纳米粒子的外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层；所述石墨烯量子点的外表面包裹一层聚丙烯酸；所述上转换纳米粒子通过表面的氨基与所述石墨烯量子点表面的羧基形成酰胺键连接在一起。所述复合材料的形状为球形，粒径尺寸为35nm。
本发明提供的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料，其中石墨烯量子点的吸收光谱能够与上转换纳米粒子的发射光谱很好的重合在一起，所以两种材料会发生能量传递。当两者接触在一起时，在980纳米激光的照射下，上转换纳米粒子能够吸收近红外光，并发射出紫外光和可见光，发射出的紫外和可见光可以被石墨烯量子点吸收，与周围的氧气反应产生具有细胞毒性的单线态氧，同时发射出红光，从而实现近红外激发下的光动力学治疗和荧光成像。
本发明还提供一种同时实现近红外光动力学治疗和荧光成像的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料的制法，包括以下步骤：
步骤1、制备上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+
在氩气保护下，将ycl3·6h2o、ybcl3·6h2o和ercl3·6h2o与油酸和油胺混合均匀，使用控温电热套加热至形成均一的溶液；待溶液冷却到室温后，加入naoh和nh4f的甲醇溶液并搅拌；随后，升温、抽真空，以除去溶液中的甲醇、氧气和水分；再向溶液中通氩气，并将温度升高到300℃，保持1小时，待溶液冷却到室温后，将得到的纳米晶用无水乙醇沉淀下来，并用环己烷和乙醇交替清洗，得到上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+；
步骤2、上转换纳米粒子外表面包裹一层二氧化硅并修饰氨基
将步骤1得到的上转换纳米粒子分散在环己烷中，再加入曲拉通x-100，正己醇和水，搅拌至形成均相溶液；随后，加入氨水、正硅酸乙酯和丙氨基三乙氧基硅烷，室温下搅拌；再向该反应体系中加入丙酮将产物沉淀析出，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子；
步骤3、制备石墨烯量子点
将甲酰胺溶液放置在高压反应釜中，并在160℃下加热1个小时，待反应体系降温到室温后，反应产物用水稀释并用透析袋透析，最后，得到暗绿色溶液，将该暗绿色溶液用滤膜过滤以除去大的残留物，再真空蒸干，得到石墨烯量子点；
步骤4、用聚丙烯酸包裹石墨烯量子点
将聚丙烯酸溶解在水中，超声得到均匀的溶液，再将该溶液与步骤3得到的石墨烯量子点的水溶液混合，并室温搅拌，离心，清洗，烘干，得到外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点；
步骤5、制备上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料
将步骤4得到的外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点分散在水中，加入edc和nhs，搅拌均匀，再加入步骤2得到的外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子，继续搅拌，最后，将溶液离心，并用二次水清洗，烘干，得到上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料。
本发明提供的制法制备的上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料，石墨烯量子点能很好的与上转换纳米粒子结合在一起，形状为均一的球形，粒径尺寸大约为35nm。该复合材料在980nm近红外光照射下可以产生单线态氧，对细胞进行杀伤；并且该复合材料能够进入细胞内，实现近红外下的红色荧光成像。
实施例
步骤1、制备上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+
0.8mmolycl3·6h2o，0.18mmolybcl3·6h2o，0.02mmolercl3·6h2o与6ml油酸和15ml油胺氩气保护下，在50ml三颈烧瓶中搅拌混合均匀。使用控温电热套加热到160℃形成均一的溶液，并保持一小时，可以看到稀土盐溶解。待溶液冷却到室温后，加入10ml含2.5mmolnaoh和4mmolnh4f的甲醇溶液并搅拌30分钟。随后，升温到100℃抽真空，以除去溶液中的甲醇、氧气和水分。再向溶液中通氩气，并将温度升高到300℃，保持1个小时。待溶液冷却到室温后，将得到的纳米晶用无水乙醇沉淀下来，并用环己烷和乙醇交替清洗三次，得到上转换纳米粒子β-nayf4:yb3+,er3+。得到的产物可以很好的分散在环己烷中。
步骤2、上转换纳米粒子外表面包裹一层二氧化硅并修饰氨基
称取25mg步骤1得到的上转换纳米粒子分散在3.35ml环己烷中，再加入4.15ml环己烷，1.8ml曲拉通x-100，1.8ml正己醇和450μl水，搅拌30分钟以形成均相溶液；随后，加入100μl氨水，150μl正硅酸乙酯和50μl丙氨基三乙氧基硅烷，室温下搅拌24小时；在该反应体系中加入丙酮将产物沉淀析出，并用无水乙醇洗涤两次，60℃真空干燥，得到外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子。
步骤3、石墨烯量子点的制备
将含有质量比为3％的50ml甲酰胺溶液在放置在高压反应釜中，并在160℃下加热1个小时。待反应体系降温到室温后，反应产物用250ml水稀释并用截留分子量3500da的透析袋透析一个星期。最后，得到暗绿色溶液。将该暗绿色溶液用0.22μm的滤膜过滤以除去大的残留物。将得到的最终的溶液真空蒸干得到石墨烯量子点产物。
步骤4、用聚丙烯酸包裹石墨烯量子点
将3g聚丙烯酸溶解在15ml水中，超声得到均匀的溶液。再将该溶液与步骤3得到的石墨烯量子点的水溶液混合，并室温搅拌24小时，离心，清洗，烘干得到外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点。
步骤5、上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料的制备
取0.05g步骤4得到外表面包裹一层聚丙烯酸的石墨烯量子点分散在10ml水中，加入1ml6mg/ml的edc和1ml2mg/ml的nhs，搅拌均匀，再加入0.1g步骤2得到的外表面包裹一层修饰有氨基的二氧化硅层的上转换纳米粒子，继续搅拌至少6小时，最后，将溶液离心，并用二次水清洗3次，30℃烘干，得到上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料。图2(a)、(b)和(c)分别给出了步骤3制备的石墨烯量子点，步骤1制备的上转换纳米粒子和最终制得的上转换纳米粒子-石墨烯量子点的透射电镜图。从图中可以看出，石墨烯量子点很好的与上转换纳米粒子结合在一起，该复合材料的尺寸大约为35nm。
6、上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料单线态氧产生能力测试
将步骤5得到的复合材料配置成5mg/ml的水溶液。依次用pbs稀释成400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml和12.5μg/ml。将稀释的溶液各取20μl放在96孔板孔中，每个浓度做三个平行试验。再在各个孔中加入80μl12μm的sosg甲醇溶液。为了检验复合材料产生活性氧的能力，用同样体积的pbs做对照试验。将96孔板在摇床上摇匀，置于酶标仪上，用394nm光激发，检测复合材料的荧光光谱。从荧光谱图图3可以看出，与pbs相比，本发明的复合材料在540nm处的峰强度非常高。这说明本发明的复合材料在980nm激光下可以生成单线态的氧这种自由基。
步骤7、上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料对mcf-7细胞光动力学杀伤能力测试
使用mtt法检测复合材料对mcf-7乳腺癌细胞的杀伤能力。使用96孔板培养细胞，每个孔里的细胞数目为1*104个。将培养好的mcf-7细胞中使用对倍稀释的方法加入400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml和12.5μg/ml的复合材料，每个浓度重复三个孔，没有加复合材料的细胞作为对照组实验。将细胞继续在37℃co2培养箱中培养6个小时。然后将细胞放在980nm近红外光源下照射，功率为1.5w/cm2，照射时间为10分钟。照射结束后将细胞继续在37℃co2培养箱中培养18个小时。最后进行mtt检测来得到细胞的存活率。从图4中可以看出，随着复合材料浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低。这说明，在980nm激光照射下，复合材料能够产生单线态氧，对细胞进行杀伤。
步骤8、上转换纳米粒子和石墨烯量子点复合材料近红外荧光成像能力检测
使用12孔板培养细胞。将培养好的mcf-7细胞中加入800μl25μg/ml的复合材料并继续过夜。用pbs清洗3次以去除没有能够进入到细胞内的复合材料。最后，将12孔板放在倒置显微镜下，用980nm近红外光照射，拍摄细胞的发光情况。从图5可以看出，细胞膜内呈现明显的红色。与白光条件下拍摄的照片进行叠加后，可以很好的重合的一起。这说明复合材料可以进入到细胞内，实现近红外下的荧光成像。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。